08_B_P_21_v1 I7- Immunologie Fiche sujet - candidat LE TEST D IMMUNODIFFUSION OU TEST D OUCHTERLONY : RECHERCHE D UN ANTIGÈNE
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- Nicole Sylvain
- il y a 6 ans
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1 Fiche sujet - candidat A des fins expérimentales, des lapins reçoivent par injection un antigène. Ils produisent alors des anticorps spécifiques contenus dans leur sérum dont la présence peut être mise en évidence par la méthode d Ouchterlony. On cherche à identifier l antigène injecté à un lapin. Matériel : - une plaque chauffante et une balance électronique, un bécher, une éprouvette graduée ou équivalent 0 ml - une coupelle, une pince en bois, un flacon d Agar, un flacon d eau distillée, une spatule, du papier absorbant - une boîte de Pétri (6 cm de diamètre) ; une pipette 0 ml et pipeteur, un tube emporte-pièce et un cure-dent ou une aiguille lancéolée - un marqueur (pour marquer la boîte de Pétri), un récipient poubelle - sérum du lapin (= S) contenant des anticorps dirigés contre l antigène inconnu injecté - eau distillée (= E) et 4 solutions d antigènes protéiques : pancréatine= P ; caséine= C ; hémoglobine= H ; albumine de sérum de bœuf (BSA)=B - une micro-pipette avec embouts ou un compte-goutte pour chaque produit, un chronomètre, des gants ; une lampe de bureau et une petite feuille de papier noir Activités et conditions des activités Capacités et principaux critères d'évaluation Barème Réaliser une manipulation d après un protocole respect des étapes du protocole 3 utilisation maîtrisée du matériel organisation de la paillasse. Réaliser la partie I du protocole de la fiche technique candidat. Appeler l examinateur pour vérifier la qualité de la boîte et obtenir éventuellement une boîte de secours. Après lecture du protocole de la fiche technique candidat (partie II et III), choisir la disposition des produits dans la boîte de Pétri et l indiquer sur le schéma de la fiche réponse candidat. Justifier ce choix. Appeler l examinateur pour vérifier et obtenir éventuellement un document de secours Comprendre la manipulation 3 3. Réaliser les parties II et III du protocole de la fiche technique candidat. Appeler l examinateur pour obtenir les résultats Réaliser une manipulation d après un protocole 6 4. Indiquer sur le schéma de la fiche réponse le résultat du test. 5. Dans chaque cas (formation de l arc de précipitation, ou absence d arc), réaliser un schéma d interprétation à l échelle moléculaire, en utilisant la symbolisation proposée dans la fiche réponse-candidat. 6. A partir des résultats fournis, déterminer quel est l antigène injecté au lapin. Justifier votre réponse. 7. Ranger le poste de travail. Traduire des informations par des schémas Appliquer une démarche explicative Gérer et organiser le poste de travail Respecter les consignes de sécurité 5
2 Fiche technique - candidat Principe de la méthode d Ouchterlony C est une méthode d immunodiffusion sur gel : les solutions déposées dans les puits creusés dans le gel diffusent de façon homogène dans toutes les directions autour du puits. Deux auréoles de diffusion peuvent donc entrer en contact lorsqu elles ont suffisamment progressé. Cette zone de contact reste invisible s il n y a pas de réaction entre les deux solutions. Quand il y a réaction entre les solutions, il se forme un arc de précipitation visible à l œil nu. Celui-ci est dû à l interaction entre de nombreux anticorps et les antigènes spécifiques, entraînant la formation de complexes immuns. Le temps de réaction est de l ordre de 4h (c est la raison pour laquelle, après avoir réalisé le protocole, vous disposerez, pour lire les résultats, d une boîte préparée à l avance). de précipitation PROTOCOLE A chaque étape en cas d erreur vous pouvez utiliser des boîtes de secours pour reprendre votre manipulation là ou vous avez fait l erreur. I- Préparation d un gel d Agar à couler dans une boîte de Pétri pour test d Ouchterlony. Organiser votre plan de travail pour manipuler proprement en suivant les consignes de sécurité.. Peser dans la coupelle 0,g d Agar prélevés à l aide de la spatule. 3. Verser 4 ml d eau distillée puis l Agar dans le Bécher et dissoudre soigneusement l Agar avec la spatule. 4. Chauffer le mélange en remuant à la spatule jusqu à ce que le mélange devienne limpide et arrêter au tout début de l ébullition. 5. Retirer à l aide de la pince en bois, attendre quelques secondes que le Bécher refroidisse afin pouvoir saisir le flacon sans se brûler. 6. Pipeter 5 ml de gel d Agar chaud et fluide et le verser dans une boîte de Pétri. 7. Egaliser le niveau et supprimer rapidement les bulles. 8. Laisser la boite refroidir sans mettre le couvercle. 9. Ne pas remuer les boîtes avant prise du gel d Agar : environ 5 mn. II- Préparation du test. Utiliser le gabarit de perçage ci-contre (ou celui qui vous est fourni) pour creuser à l aide du tube emporte pièce les puits nécessaires dans le gel d Agar.. Eliminer les disques de gélose avec le cure-dent si nécessaire. Gabarit de perçage dans le gel d Agar III- Réalisation des dépôts. Marquer sur la boîte de Pétri la disposition des produits à déposer dans les puits permettant de révéler la réaction de l anticorps étudié avec les différents antigènes proposés. (Utiliser le même ordre que celui que vous avez proposé à la question ).. Remplir les différents puits avec µl ou gouttes : chaque produit devra être prélevé avec un compte goutte propre ou une micropipette à embout propre, puis être déposé dans les puits sans débordement ni bulle et sans endommager le gel d agar. 3. Fermer la boite. 4. Observer les résultats fournis sur fond noir et en éclairage rasant.
3 Fiche réponse - candidat ETABLISSEMENT : Classe : Nom : Prénom : Schéma à compléter Symbolisation de l anticorps à utiliser pour réaliser votre schéma. SCHEMAS A rendre à l issue de l épreuve - Utiliser le verso si nécessaire
4 Fiche barème d évaluation Capacités et critères d évaluation Barème (en gras, évaluation pendant de la séance). Comprendre la manipulation : - puits central avec sérum de lapin ; puits périphériques contenant chacun un antigène ou l eau distillée - justification : possibilité de rencontre entre les anticorps du sérum central et tous les antigènes périphériques* * fournir un document de secours au candidat qui ne franchit pas cette étape.. et 3. Réaliser une manipulation d après un protocole - respect des étapes du protocole : pipetage, dissolution, chauffage pour préparation de la gélose - obtention d un gel «propre» (surface égalisée, pas de bulle) - réalisation soignée des 6 puits en respectant le gabarit - marquage efficace des puits sur la boîte - utilisation judicieuse du matériel : à vérifier lors de la manipulation ( compte-goutte par produit, dépôts soignés sans débordement, qualité du pipetage, dépôt des produits conforme au marquage) 3 4. et 5. Représenter une observation par un schéma - tracé de l arc correctement placé - schémas soignés, titres pertinents - schéma du complexe immun : traduisant complémentarité Ag-Ac et la formation d un réseau correspondant à l arc de précipitation 3 - schéma en absence d arc : donc absence de complémentarité Ac-Ag 6. Appliquer une démarche explicative pour répondre au problème posé - l antigène injecté au lapin est la BSA - justification = arc de précipitation entre le sérum et le puits contenant la BSA, spécificité antigène anticorps. Notion de complexe immun 7. Gestion et organisation du poste de travail y compris rangement final en respectant les consignes de sécurité Note / 0 Nom des candidats
5 Fiche laboratoire et évaluateurs / Matériel : - une plaque chauffante et une balance électronique, un bécher, une éprouvette graduée ou équivalent 0 ml - une coupelle, une pince en bois, un flacon d Agar, un flacon d eau distillée, une spatule, du papier absorbant - une boîte de Pétri (6 cm de diamètre) ; une pipette 0 ml et pipeteur, un tube emporte-pièce et un cure-dent ou une aiguille lancéolée - un marqueur (pour marquer la boîte de Pétri), un récipient poubelle - sérum du lapin (= S) contenant des anticorps dirigés contre l antigène inconnu injecté - eau distillée (= E) et 4 solutions d antigènes protéiques : pancréatine= P ; caséine= C ; hémoglobine= H ; albumine de sérum de bœuf (BSA)=B - une micro-pipette avec embouts ou un compte-goutte pour chaque produit, un chronomètre, des gants ; une lampe de bureau et une petite feuille de papier noir Il peut être envisagé d introduire un code pour associer pipettes et solutions (gommettes, feutres ). Ce repérage facilite l évaluation. MATERIEL NECESSAIRE A LA PREPARATION - boîtes de Pétri (verre ou plastique), de diamètre 5 à 6 cm (par candidat boîtes vides et boîte résultat (fournie à la question 3), cette dernière éventuellement remplacée par la fiche de résultats en cas d impossibilité de préparation) ; - gabarit de perçage des puits : certains lycées utilisent comme gabarit de perçage des couvercles de boîtes de Pétri percés de trous ; les fournir alors au candidat ; - Agar en poudre (g pour 0 boîtes) ; - eau distillée (00mL pour 0 boîtes) ; - emporte pièce (pipette ou tube en verre de diamètre 6mm) ; certains lycées utilisent des tubes munis de poires d aspiration, les fournir alors au candidat ; - aiguille lancéolée ou cure-dent ; - compte-gouttes (un par produit) ou micro-pipettes (un embout par produit). S assurer que le volume des gouttes est compatible avec le volume des trous réalisés dans la gélose compte tenu de l emporte pièce, du compte-goutte ou de la micro-pipette utilisés; - Prévoir des pipettes de rechange entre chaque rotation car la gélose fige et bouche les pipettes ; - Fournir la lampe et le papier noir uniquement si on choisit de donner une boîte de résultat réel et non le cliché résultat au candidat ; - Eviter le bain marie sinon le délai de chauffage est trop long et la T C obtenue n est pas toujours suffisante. S assurer que la plaque chauffante utilisée permet un délai de chauffage compatible avec la durée de la manipulation. Indiquer aux candidats à quelle intensité utiliser la plaque chauffante ; - Prévoir de la glace ou un pain réfrigérant pour accélérer la solidification de la gélose s il fait très chaud dans la salle. PREPARATION DE BOITES DE GELOSE DE SECOURS ET BOITES DE RESULTATS Les boîtes peuvent être préparées la veille. Les quantités sont données pour 0 boîtes : - préparer 50 ml d une solution d agar-agar à,5% dans le PBS ph 7, ; - placer 5 ml de la solution tiède dans les boîtes de Pétri ; - laisser reposer 0 min à température ambiante ; - découper une rondelle de papier filtre du diamètre interne du couvercle, l imprégner d eau et la placer dans le couvercle.
6 Fiche laboratoire et évaluateur / PREPARATION DE BOITES RESULTATS AU MOINS 4H AVANT L EPREUVE (en cas d impossibilité on utilisera la «fiche résultats - candidat») - Creuser et remplir les puits selon le protocole (fiche technique candidat) et le document résultat candidat ; - Les puits ayant été remplis avec les réactifs grâce à une pipette Pasteur ou un compte goutte fin (sans bulles ni débordement), l incubation est réalisée en plaçant les boîtes dans la chambre humide à température ambiante ; - La lecture peut se faire au bout de 4 à 48 h, en plaçant les boîtes sur un fond noir et éventuellement en éclairage rasant ; - Pour conserver les résultats, placer alors les boîtes à 4 C. Pour éviter l utilisation de produits on pourra : utiliser des boîtes de résultats conservées au congélateur après un TP formatif (veiller à ce que les désignations et la position de l arc soient corrects), faire des boîtes avec des sérums restants après le TP formatif, conservés au congélateur (au minimum le sérum anti-bsa et la solution de BSA nécessaires pour obtenir l arc. Utiliser alors le même protocole que pour le TP formatif. FOURNISSEURS : - SIGMA, l Isle d Abeau Chesnes BP 70, 3897 ST QUENTIN FALLAVIER ; tampon PBS en pastilles, sérums divers, protéines antigéniques... (section immunologie du catalogue) ; - SORDALAB, ZA des Poupettes, 9580 VILLENEUVE SUR AUVERS ; kit test d Ouchterlony. REMARQUES A L ATTENTION DE L EXAMINATEUR Remplissage des puits - Compléter une des cases prévues à cet effet dans le protocole de la fiche technique candidat en fonction du matériel à disposition des candidats. Evaluation de la question - Fournir un document de secours au candidat qui ne franchit pas l étape de la question ; - L examinateur doit être exigeant sur la réalisation du protocole et par conséquent être présent auprès du candidat au moment où celui-ci distribue les produits (point 3 du protocole) dans les puits de manière à noter au plus juste le point de la grille d évaluation. Rôle des boîtes de secours - Si une boîte de secours est fournie, le candidat n obtient pas les points correspondants à l'étape non réussie mais peut continuer l épreuve et obtenir tous les autres points. Rôle du document de secours - Le document de secours n est fourni que si le candidat n a pas placé l anticorps dans le puits central ; on admet toute disposition pour les puits périphériques ; - Si le document de secours est fourni, le candidat n obtient pas les points correspondants à la question mais peut continuer l épreuve. Le document de secours et le document résultats peuvent être imprimés (impression couleur de bonne qualité) ou affichés à l écran : utiliser alors les documents affichables : Oucht_ag_secours et Oucht_ag_result Prescriptions Autorisations Blouse Gants Lunettes Calculette Papier brouillon Oui, non fournie Oui, fournis non non Fourni par l établissement.
7 Fiche secours - candidat BOITE PRESENTANT LA DISPOSITION DES PRODUITS DANS LES PUITS
8 Fiche résultats candidat A n utiliser qu en cas d impossibilité de préparation d une boîte de résultats par le laboratoire BOITE DE RÉSULTATS PRESENTEE SUR FOND NOIR ET ÉCLAIRAGE RASANT Les résultats présentés ci-dessous ont été obtenus dans les mêmes conditions expérimentales avec les produits réels : sérum de lapin immunisé et solutions antigéniques.
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