II) en une protéine fonctionnelle : une activité complexe dont le résultat est difficilement prévisible?

Transcription

1 L'expression d'un gène (classe II) en une protéine fonctionnelle : une activité complexe dont le résultat est difficilement prévisible? T. Arnould Séminaire Résidentiel Interdisplinaire Faculté des Sciences janvier 2009 Duinse Polders Blankenberge

2 Partie I : l expression de gènes Plan de l exposé * Les acteurs et mécanismes de base : ADN Transcription : les facteurs de transcription et les activateurs Traduction Partie II : la régulation de l expression de gènes est le résultat de nombreuses influences opposées - activation ou répression * Nécessité de l intégration des signaux Régulation transcriptionnelle : Interactions au niveau du promoteur et combinatoire des facteurs de transcription activateurs et cofacteurs (ADN) Régulation épigénétique (ADN et chromatine) Régulation post-transcriptionnelle transcriptionnelle (ARNm) Régulation de la traduction (Protéines) Régulation post-traductionnelle traductionnelle (Protéines)

3 Le dogme central ADN

4 Les protéines fonctionnelles qui assurent la chimie cellulaire destination finale du voyage Les protéines : - représentent plus de 50 % de la masse sèche des cellules - interviennent dans toutes les fonctions cellulaires Grande variété et diversification énorme des structures-fonctions Structure : une classe de protéines (fibreuses) peut comporter des molécules très différentes (kératines, fibrine caillot sanguin, collagène, fibroïne de la soie, ) Fonction : les enzymes = catalyseurs (protéines globulaires)

5 Les acides aminés : briques de construction des protéines La liaison peptidique Polymère linéaire composé d acides aminés s (20 différents) polyméris risés s dans un ordre bien défini (= séquence) s La chaîne latérale (R) : détermine les propriétés s spécifiques de chaque acide aminé Structure - Fonction Augmentation de la température, ph, changements [sels],

6 Les gènes codent 1 à 2 % de l ADN 3, paires Qu est-ce qu un gène? gènes codent pour des protéines pas toujours!!! l ADN - chez l homme : paires de bases ± gènes mais ± 10 6 de protéines (4 mécanismes : EA, PA, MPT et mrna editing ) Domestiques : tout le temps dans toutes les cellules Spécifiques : tout le temps dans certaines cellules Régulés : à certains moments dans certaines cellules

7 La Transcription du gène en un transcrit (ARNm)) stable

8 Promoteur : courte séquence d ADN non transcrite par l ARN Pol mais qui s y lie (fort ou faible) Rôle du promoteur central/proximal d un gène : recruter l ARN pol par l intermédiaire de facteurs de transcription Complexe d initiation eucaryote + 1 Promoteur central

9 La transcription de l ADN en copies d ARNm : ARN polymérase II Schéma d une bulle de transcription ± 50 à 200 nucléotides/s Elongation et Terminaison

10 Les facteurs de transcription Les facteurs généraux de transcription : nécessaires à l initiation de la synthèse de l ARN au niveau des gènes de classe II. Ils forment avec l ARN pol II un complexe au niveau du site d initiation de la transcription et déterminent ainsi le site de démarrage de la transcription Les facteurs de transcription spécifiques : possèdent un rôle régulateur et participent à l induction ou à la répression. Ils sont synthétisés ou activés d une manière spécifique dans les cellules en réponse à des signaux. Les séquences qu ils reconnaissent sont appelées les éléments de réponse.

11 Les promoteurs eucaryotes : complexes, spécifiques et capables d être liés par des facteurs de transcription spécifiques/activateurs (± 1000) qui lient des séquences particulières res en amont. Ils contrôlent le niveau d expression d d un gène à la demande en en fonction des conditions

12 Modifications post-transcriptionelles transcriptionelles de l ARNm Protège de la dégradation : stabilité de l ARNm Initiation de la traduction Addition d un GTP méthylé à A ou G

13 La Traduction en une protéine conformée

14 Le code génétique est à triplets Il faut 3 nucléotides pour spécifier un acide aminé donné Ce qui offre 4 3 = 64 possibilités. Brin transcrit/modèle ADN Le cadre de lecture A AUU GCC GUG C.. et non..aau UGC CGU GC.. Ile - Ala - Val Asn - Cys - Arg

15 Les ribosomes Complexes d ARN ribosomiques (ARNr : principales unités catalytiques) ) et de protéines ribosomiques (rôle structural) ribozyme Structure atomique : 0,24 nm Sites : E (exit) P (peptidyl( peptidyl) A (aminoacyl( aminoacyl)

16 La traduction La série de codons alignés sur l ARNm est «interprétée» par une série de molécules d ARN de transfert (ARNt). Les différents ARNt fixent chacun un acide aminé pour l acheminer vers les ribosomes. Cette réaction est catalysée par différentes aminoacyl-arnt synthétases qui sont des enzymes d activation. Chaque ARNt traduit un certain codon de l ARNm en l acide aminé correspondant. ARNt

17 Initiation de la traduction des transcrits en protéines (Holick et al., Nature Molecular Biol Rev,, 2005) * Poly A : A (stabilité - traduction)

18 L élongation de la traduction Les acides aminés sont ajoutés un à un selon un cycle de trois phases : - reconnaissance du codon par l ARNt correspondant (2 GTP) - formation de la liaison peptidique - translocation : le ribosome passe au codon suivant, l ARNt portant la protéine en croissance passe du site A au site P et l ARNt vide passe au site E avant de quitter le ribosome (1 GTP).

19 La terminaison de la traduction Quand le ribosome arrive au codon stop (UAG, UAA ou UGA pour lesquels il n existe pas d ARNt), un facteur de terminaison se lie, ajoute une molécule de H 2 O au dernier acide aminé pour hydrolyser la liaison protéine-arnt et la protéine est libérée. L ARNm et les deux sous-unités du ribosome se dissocient ensuite.

20 Transcription et traduction : résumé

21 Partie II : Quelques exemples de régulations dont la combinatoire est complexe et rend difficile le pronostic du résultat de l expression d un gène donné Les nombreux niveaux soumis à de très nombreuses régulations donnent parfois des surprises sur le résultat attendu

22 Intégration : des voies de signalisation cellulaires conduisent à activer les facteurs de transcription L929 Série d événements séquentiels. la bonne protéine à la bonne place au bon moment en bonne quantité L929 (mtdnad) N N N N

23 Parmi les mécanismes d activation des facteurs de transcription : le clivage protéolytique contrôl ôlé ou partiel (Cholestérol-SREBPs) QuickTime et un décompresseur TIFF (non compressé) sont requis pour visionner cette image. QuickTime et un décompresseur TIFF (non compressé) sont requis pour visionner cette image. Bengoechea-Alonso and Ericsson, 2007

24 La phosphorylation d un facteur de transcription : l origine de son activation ou de son inactivation (changement de localisation, répulsion avec l ADN, )

25 Modifications post-traductionnelles traductionnelles d un facteur de transcription : p53 (Olsson, et al., 2007, Cell Death and Differentiation) QuickTime et un décompresseur TIFF (non compressé) sont requis pour visionner cette image. Domain-structure of human p53. The p53 protein consists of six major domains: TAD1 and 2; amino-acid residues 1ミ43 and 44ミ60; the PRD, residues 40ミ92; the DBD, residues 100ミ300, the 4D, residues 307ミ355, and the CTD, residues 356ミ393). NLS, nuclear localization signal; NES, nuclear export signal. Post-translational modifications are depicted in the individual domains of p53: P (phosphorylation), Ac (acetylation), Ub (ubiquitination), M (methylation), and SU (sumoylation) L activité transactivatrice (et autre) est fonction de l intégration de ces signaux une combinatoire difficile à prédire

26 L activité des facteurs de transcription contrôl ôlée en amont par les voies de signalisation QuickTime et un décompresseur sont requis pour visionner cette image. Expression de gènes

27 Un promoteur : contient de nombreux sites de liaisons pour de multiples facteurs de transcription YY1 YY1 Sp1 YY1SREBP Sp1 YY1 YY1TATA LDLr CCAT/ACAT Affinités de liaison différentes Compétitions (sites reconnus par 2 ou plusieurs facteurs de transcription) Coopération (SREBP + Sp1 : renforcement) Antagonisme : YY-1, effet répresseur Saturation biphasique des sites (1 site + et 1 site - pour un même facteur de transcription)

28 Les facteurs de transcription activés s (monomériques ou homo-/h /hétéro-multimériques recrutent des cofacteurs (co-activateurs ou co-répresseurs presseurs )

29 Une difficulté de prédiction : l interférence des voies de signalisation conduisant à des signaux contradictoires

30 Cahill et al., Febs Letters, 1994 Regulation par squelching Domaines de transactivation d un FT est en interaction avec des coactivateurs/co-répresseurs (faible abondance). Plusieurs domaines de transactivation de différents FT compètent pour ces molécules Squelching : modification de la transcription d un gène donné suite à la séquestration de molécules en quantités limitantes (coactivateurs/co-répresseurs) par d autres FT activés au niveau d autres promoteurs

31 Les cofacteurs (co-activateurs ou co-répresseurs) directs ou indirects possèdent souvent, respectivement, une activité Histone Acetyl-Transferase (HAT) ou Histone Deacetylase (HDAC)

32 L accessibilité des acteurs à l ADN : mécanismes épigénétiques Variations héritables dans l expression génique après division cellulaire (mitose/méiose) qui ne sont pas provoquées par des changements dans la séquence de l ADN Mécanismes : Méthylation de l ADN et modifications post- traductionnelles des histones Impact : remodeler la chromatine en domaines euchromatine, ou hétérochromatine constitutive ou facultative

33 Localisation des modifications épigénétiques sur les queues des histones : un code difficile une même m modification peut avoir des effets opposés s selon l histone touchée QuickTime et un décompresseur TIFF (non compressé) sont requis pour visionner cette image.

34 Euchromatine versus Hétérochromatine qu est qu est-ce qui change? QuickTime et un décompresseur TIFF (non compressé) sont requis pour visionner cette image.

35 Enzymes de modifications : une balance subtile entre des activités opposées QuickTime et un décompresseur TIFF (non compressé) sont requis pour visionner cette image.

36 Impact global et simplifié des régulations épigénétiques sur la transcription : acétylation et méthylation (ADN/Histones) Chromatine non condensée "beads on a string" + PRC : condensation et aggrégation en «clumps» A = H4 Acétylation M = H3 K9 Méthylation M= DNA Méthylation

37 Modifications de la chromatine : un mécanisme à la base de la différenciation cellulaire

38 Modifications épigénétiques dans les cancers

39 Régulation post-transcriptionnelle de l expression par des mirna (microrna) * ARN double-brin de ~22 bp généré à partir d un transcript endogène de nt (premirna) avec une structure hairpin. => La voie des mirna est un mécanisme utilisé par la cellule pour réguler l expression génique au niveau post-transcriptionnel. Chez l homme : ± 1000 Base de données mirna: PRIX NOBEL Médecine/Physiologie 2006 : Caractérisation de l effet RNAi chez Caenorhabditis elegans Fire A., Mello C. (1998) Nature 391 p 806

40 + Aconitase La phosphorylation du facteur eif2α bloque la traduction (Holick,, Nature Molecular Biol Rev,, 2005)

41 Les modifications post-traductionnelles traductionnelles changent l abondance, l état fonctionnel, la localisation d une protéine et la nature de ses partenaires (Mann and Jensen, Nature Biotech 2003) Phosphorylation ptyr pser,pthr Réversible, Activation/Inactivation Modulation interactions Signalisation Ubiquitination Lys Signal de dégradation protéasome Stabilité protéique Formation ponts disulfures -S-S- Intra-Intermoléculaires Stabilité protéique Glycosylation N-linked O-linked Protéines sécrétées/intra Interactions cellules-cellules Signalisation O-GlcNAc Régulation activité enzymes Protéines Acétylation Histones, Modulation interactions Protéines-DNA Stabilité des protéines Sulfatation Tyr Modulation interactions protéines Récepteur-ligand Méthylation DNA/Histones Régulation expression de gènes Acylation Farnesylation Myristoylation Palmitoylation Localisation cellulaire Médiateur interactions protéiques Signalisation Hydroxylation Proline Stabilité Interactions protéines Nitrosylation Tyr Module les interactions, la localisation et la stabilité

42 L abondance d une protéine : un équilibre entre synthèse et dégradation ( turn over et steady state ) Core 20S : 28 sous unités α7,β7, β7, α7 chymotrypsin-like, trypsin-like, and peptidylglutamyl peptide hydrolysing (PGPH)

43 Conclusions I. Malgré la complexité chaque chaque cellule de notre corps exprime des dizaines,, des centaines, voir des milliers de gènes à chaque instant et ce, en nombreuses copies de protéines fonctionnelles II. Pour les techniques d étude et les pronostics : attention à utiliser une méthode qui rende le mieux compte de la protéine fonctionnelle et attention aux prédictions non validées sur base de résultats obtenus pour des événements très précoces (activation d un facteur de transcription, abondance relative d un transcrit, ).

44 Pour une vision dynamique de certains mécanismes et processus mentionnés ms2ls&feature=related Merci de votre attention