ETUDE DE LA SPECIFICITE DES ENZYMES DIGESTIVES Le rôle des enzymes dans l approvisionnement du sang en glucose,

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1 Le rôle des enzymes dans l approvisionnement du sang en glucose, Le glucose est un nutriment essentiel aux cellules. Il provient de notre alimentation, après la digestion de certains aliments. Par exemple les féculents (lentilles, pois chiches ) contiennent des glucides complexes comme l amidon. Au cours du processus digestif, cet amidon est transformé en glucides plus simples. Voyons comment s effectue cette digestion, ou plus précisément, ce qu est la catalyse enzymatique. a) Activité 1 : Mettre en évidence l activité d une enzyme : l amylase salivaire. Question n 1 (Temps à consacrer =20 ) : réaliser le protocole proposé dans la fiche TP1 et appeler le professeur pour lui proposer votre conclusion. Protocole proposé : Remarque : On rappelle que l amidon est mis en évidence par le lugol (=eau iodée) en donnant une coloration bleue et qu un glucide réducteur (glucose ou maltose) est mis en évidence à chaud par la liqueur de Fehling. On obtient un précipité rouge-orangé. Bilan : b) Activité 2 : Montrer que les conditions du milieu influencent l activité enzymatique, Question n 2 : A partir du matériel suivant, proposez un protocole expérimental permettant d étudier l influence de la température sur l activité enzymatique.

2 Matériel : ETUDE DE LA SPECIFICITE DES ENZYMES DIGESTIVES Salive, Eau iodée (=lugol) Bain-marie, Eau bouillante, Empois d amidon, Réfrigérateur, Solution de soude, Acide chlorhydrique, Tubes à essais, Question n Réalisez le protocole distribué (fiche TP2) et rédigez un compte-rendu à votre convenance, incluant le protocole, les résultats et une interprétation de l expérience. Protocole proposé : Question n 4 : Commentez les documents n 1 à 3 ci-après pour compléter vos précédents résultats. Document 1 : Document 2 :

3 Document 3 : Question n 5 : Observer les effets des variations de température et de ph sur la structure d une enzyme. Visiter le site web suivant : et choisir Enzymes.

4 Mise en situation et recherche à mener L industrie pharmaceutique cherche à mettre au point à moindre coût un médicament à prise orale facilitant la digestion de l amidon dans l'intestin. Le principe actif de ce médicament est une enzyme, l'alpha-amylase, qui catalyse la digestion de l amidon. Cette enzyme est active dans les conditions de ph rencontrées dans l'intestin grêle mais pas dans l'estomac. Si l'acidité de l'estomac conduit à une perte d'activité définitive, les industriels devront enrober le médicament avec une capsule. La capsule protégera l'alpha-amylase dans l'estomac et permettra sa libération sous forme active dans l'intestin. On cherche à déterminer s'il est nécessaire d'enrober l'alpha-amylase dans une capsule afin qu'elle soit active dans l intestin à la suite de l'action du ph faible dans l'estomac. Ressources Document : Schéma des organes du tube digestif avec les conditions physicochimiques rencontrées par le bol alimentaire Matériel disponible : -amylase Etape 1 : Concevoir une stratégie pour résoudre une situation problème (durée maximale : 10 minutes) Proposer une stratégie de résolution réaliste permettant de déterminer s'il est nécessaire d'enrober l'alpha-amylase dans une capsule afin qu'elle soit active dans l intestin à la suite de l'action du ph faible dans l'estomac. Etape 2 : Mettre en oeuvre un protocole de résolution pour obtenir des résultats exploitables Mettre en oeuvre le protocole de digestion in vitro de l'amidon afin de déterminer s'il est nécessaire d'enrober l'alpha-amylase dans une capsule afin qu'elle soit active dans l intestin à la suite de l'action du ph faible dans l'estomac.. Etape 3 : Présenter les résultats pour les communiquer

5 Sous la forme de votre choix présenter et traiter les données brutes pour qu'elles apportent les informations nécessaires à la résolution du problème. Etape 4 : Exploiter les résultats obtenus pour répondre au problème Exploiter les résultats pour déterminer s'il est nécessaire d'enrober l'alpha-amylase dans une capsule afin qu'elle soit active dans l intestin à la suite de l'action du ph faible dans l'estomac. Matériel disponible et protocole d'utilisation du matériel Matériel : - solution d'alpha amylase à ph 7,2 - solution d alpha amylase préalablement acidifiée à ph 2 puis neutralisée à ph 7,2 - solutions d empois d amidon à 0,5 % et à ph 7,2 - eau iodée - 4 tubes à essai + bouchons - portoir pour tubes à essai - 3 pipettes graduées - 4 pipettes de 1mL - 1 plaque de coloration - 1 Chronomètre - Bain marie et Thermomètre - Marqueur - Gants et Lunettes de protection Afin de déterminer s'il est nécessaire d'enrober l'alpha-amylase dans une capsule afin qu'elle soit active dans l intestin à la suite de l'action du ph faible dans l'estomac : - Placer 2 tubes à essai avec 5 ml d'empois d'amidon à 1% et attendre qu ils soient à Faire de même avec les tubes contenant les enzymes. - Tester la présence d amidon, avec l eau iodée, dès l ajout de l enzyme. - Laisser les tubes 10 minutes à 37 C dans le bain-marie. - Tester à nouveau la présence d amidon.

6 Mise en situation et recherche à mener On trouve des glucides (amidon, glycogène, saccharose) dans de nombreux aliments. Les glycosidases sont des enzymes digestives qui catalysent l hydrolyse de ces glucides en molécules simples (glucose, fructose, galactose, ), dans le tube digestif. Celles-ci seront ensuite absorbées dans l intestin. On se demande si une glycosidase donnée a une spécificité de substrat. Ressources Document 1 :Techniques d identification et réactifs spécifiques de différents glucides Techniques et réactifs Eau iodée (ou lugol) Phénylhydrazine Liqueur de Felhing (bleue) Chromatographie Propriétés Mise en évidence : - de l amidon par une couleur violet foncé ou bleu-nuit - du glycogène par une couleur brun-acajou. Mise en évidence des glucides réducteurs par formation de cristaux de forme spécifique (osazones) identifiables au microscope Mise en évidence des glucides réducteurs : précipité rouge brique, à chaud (80-90 C) et à ph neutre. Séparation des glucides qui sont entraînés plus ou moins loin selon leurs caractéristiques physicochimiques le long d'un support. Document 2 : Propriétés réductrices de différents glucides Propriétés Réducteur Glucides Amidon Saccharose Glycogène Glucose Non Non Non Oui Matériel biologique : Solutions d empois d amidon, de glycogène et de saccharose Solution de glycosidase (fonctionnant dans l'intestin à ph7 et à 37 C) Matériel envisageable : de laboratoire (verrerie, instruments ) d observation (microscope, loupe binoculaire ) de mesure et d expérimentation (balance, chaine ExAO ) informatique et d'acquisition numérique Etape 1 : Concevoir une stratégie pour résoudre une situation problème (durée maximale : 10 minutes) Proposer une démarche d investigation permettant de tester l hypothèse qu une glycosidase donnée catalyse de façon spécifique la réaction d hydrolyse d un glucide alimentaire.

7 Fiche sujet candidat (2/2) Etape 2 : Mettre en œuvre un protocole de résolution pour obtenir des résultats exploitables Mettre en œuvre le protocole fourni pour déterminer si la glycosidase fournie (A ou B) catalyse de façon spécifique ou non la réaction d 'hydrolyse de différents substrats glucidiques Etape 3 : Présenter les résultats pour les communiquer Sous la forme de votre choix, traiter les données obtenues pour les communiquer. Etape 4 : Exploiter les résultats obtenus pour répondre au problème Exploiter les résultats pour déterminer si la glycosidase fournie a ou non une spécificité de substrat.

8 - Solution d empois d amidon à 10g/l à ph7 - Solution de glycogène à 10 g/l à ph7 - Solution de saccharose à 10g/l à ph7 - Solution de glycosidase A ou B à ph7 - Liqueur de Fehling dans un bain-marie réglé à 80 C - Tubes à essai et portoirs - Pipettes graduées et pipeteur - Bain marie, réglé à 37 C, avec thermomètre - Pince en bois - Marqueur pour tube à essai - Lunettes de protection - Eau - Chronomètre Matériel disponible et protocole d'utilisation du matériel - Réaliser les tests d hydrolyse des glucides dans les conditions expérimentales suivantes : Tubes Nature du substrat 1 Amidon 2 Glycogène 3 Saccharose 4 Amidon 5 Glycogène 6 Saccharose - Réaliser un test à la liqueur de Fehling pour chacun des tubes en respectant le principe suivant : Mélange Chauffage Résultat 1 ml de liqueur de Fehling + 2 ml de solution à tester Volume de substrat 1 ml Volume de glycosidase A ou B Deux minutes au bain-marie à 80 C. Volume d eau 1 ml 0 ml 0 ml 1 ml Temps de réaction 5 min au bainmarie Température 37 C En présence d un sucre réducteur, il se forme un précipité rouge brique. III Les enzymes structure et propriétés. Les enzymes présentent une double spécificité: spécificité d'action, et de substrat. Les propriétés des enzymes dépendent de leur structure spatiale. La structure tridimentionnelle des protéines (donc des enzymes) peut être affectée par des changements de la séquence des acides aminés (mutations) mais aussi par des facteurs de l'environnement comme le ph, la température, la présence d'ions. Quelle est l'influence de ces paramètres sur l'activité des enzymes? 1. Température du milieu et catalyse enzymatique. On étudie l'action de la température sur une enzyme salivaire: l'amylase qui hydrolyse l'amidon. Quels sont les produits que l'on obtient lorsque l'amidon est hydrolysé? Ecrire la ou les réactions. On inscrit dans un tableau, le temps mis par l'enzyme pour hydrolyser l'amidon. (1g d'amidon = Q) température en C Temps en minutes? ? Avec le tableur, tracez la courbe de la vitesse de la réaction en fonction de la t. (rappel V = Q : tps). Commentez la courbe obtenue. Vous préciserez quelle est la différence entre inactivation et dénaturation. 2. ph du milieu et catalyse enzymatique.

9 Tracez les courbes des activités des enzymes en fonction du PH. L'activité est mesurée en unités arbitraires. Vous utiliserez une couleur par courbe. ph 1 1,2 1,4 1, , Trypsine , , Maltase ,2 1 2,2 4, ,1 Pepsine + S ,5 1,5 0,9 0,7 0,3 0, Pepsine + S2 0 0,2 1,1 2,5 4 6,6 9,2 8,2 3, Pepsine + S3 0 3,7 6, , Commentez les courbes obtenues. Chercher dans quelle partie de l'appareil digestif de l'homme se trouvent ces enzymes et quel est le ph de ces différentes parties. 3. Structure de la Carboxypeptidase par imagerie moléculaire. La carboxypeptidase (CPA) est une enzyme pancréatique impliquée dans la digestion des chaînes peptidiques. Son substrat est le dipeptide (Gly-Tyr) dont elle catalyse l hydrolyse pour donner deux acides aminés libres. On souhaite donner une explication moléculaire de cette activité. Ouvrir les deux molécules avec Rastop Quelle est la forme de cette enzyme? Combien de groupements (AA) possède t-elle? 1. La structure primaire (séquence) de la protéine. Utiliser l'affichage squelette carboné avec coloration par AA. Quelle est la disposition des acides aminés? Quel est le nom du premier acide aminé? (clic gauche) Quel est le nom du dernier acide aminé? Quelle est la séquence des 5 premiers acides aminés? Utiliser une représentation en bâtonnets ou en sphères (les atomes d'hydrogène ne sont pas représentés). Quels sont les atomes qu'on retrouve dans tous les acides aminés? Quels sont les atomes qui ne sont présents que sur certains acides aminés? 2. La structure tertiaire (3D) de la protéine. Afficher Boules et bâtonnets et colorer par type d'atomes pour visualiser les acides aminés soufrés (MET et CYS). Zoom : MAJ + bouton gauche glissé - Recentrage : bouton droit glissé. Combien y a-t-il d'atomes de soufre? Participent-ils tous à des ponts disulfures? Pont disulfure = liaison covalente entre les atomes de soufre de deux AA : -S-H + -S-H + 1/2 O 2 -S-S- + H 2 O; Quels autres facteurs de réalisation d'une structure tertiaire connaissez-vous? Ecrire la formule chimique développée du substrat (compléter avec les hydrogènes non représentés). Quelle est la nature de ce substrat? La spécificité de fonction de la carboxypeptidase est l'hydrolyse. Quel substrat de cette enzyme n'est pas représenté? Réfléchir au nom de cette enzyme ; que signifie-t-il? 3. Le complexe enzyme-substrat. Le substrat s'installe sur une région particulière de l'enzyme appelée site actif Parmi les acides aminés de l'enzyme à proximité du substrat, les spécialistes considèrent que : Trois appartiennent au site catalytique proprement dit : HIS69, GLU72 et HIS196 Trois appartiennent au site de fixation : ARG145, TYR248 et GLU270 Colorier ces acides aminés et imprimer vos molécules. Si vous avez le temps, sélectionnez TYR 248 sur l'enzyme seul et sur l'enzyme + substrat : la chaîne latérale se déplace d'environ 1,2 nm au dessus du substrat et ferme le site actif! dans un petit bilan, expliquez les différences entre site actif, site catalitique et site de liaison. certaines personnes ont une CPA inactive ne parvenant pas à fixer ou à catalyser la transformation du substrat. Proposer une hypothèse pour expliquer cette anomalie? Les fichier à télécharger: o o Le fichier de la carboxipeptidase Le fichier de la carboxipeptidase et son substrat.

10 o o ETUDE DE LA SPECIFICITE DES ENZYMES DIGESTIVES carboxipeptidase seule carboxipeptidase et son substrat α amylase humaine liée à son substrat: 1MFV.pdb α amylase humaine modifiée (tryptophane 58) liée à son substrat: 1NM9.pdb Pour vérifier que tout fonctionne téléchargez des fichiers.pdb de la télomérase