CM: LES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES HUMAINES: APPARITION, DIAGNOSTIC ET APPROCHES THERAPEUTIQUES

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1 DFGSP2 Module SB2 UE11 : Biologie Moléculaire et Cellulaire Année 2016/2017 CM: LES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES HUMAINES: APPARITION, DIAGNOSTIC ET APPROCHES THERAPEUTIQUES -CHAPITRE III METHODES D IDENTIFICATION DES MUTATIONS DELETERES A L ORIGINE DES MALADIES GENETIQUES HEREDITAIRES MONOGENIQUES (DIAGNOSTIC GENOTYPIQUE) B- APPLICATIONS AU DIAGNOSTIC C- AUTRES APPLICATIONS Bernard CARCY Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire, EA 4558 «Vaccination antiparasitaire», Faculté de Pharmacie, Université Montpellier

2 I- POLYMORPHISMES DU GENOME HUMAIN ET PATHOLOGIE MOLECULAIRE (MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES) II- MECANISMES ET CONSEQUENCES DES MUTATIONS DELETERES A L ORIGINE DES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES III- METHODES D IDENTIFICATION DES MUTATIONS DELETERES A L ORIGINE DES MALADIES GENETIQUES HEREDITAIRES MONOGENIQUES (DIAGNOSTIC GENOTYPIQUE) A- METHODES DE BASE - Notions d hybridation moléculaire (Tm, sondes, amorces nucléotidiques) - Le Southern blot - L amplification génique par PCR (classique et en temps réel) - Le séquençage enzymatique d un ADN (Sanger & Coulson) B- APPLICATIONS AU DIAGNOSTIC -Le diagnostic génotypique - détection SNP par PCR ou/et séquençage -Détection RFLP ou STR/VNTR par Southern blot ou PCR -autres méthodes de diagnostic dérivées de la PCR (SSCP, DGGE, HRM, DHPLC, MLPA) et du Séquençage (NGS=pyroséquençage et SMRT) (UE optionnelle) C- AUTRES APPLICATIONS - Organisation génomique d un gène dans un génome (par Southern blot) -Détection d un gène dans une banque (par Southern ou PCR) - Tests génétiques grand public et médecine prédictive (séquençage) IV- APPROCHES THERAPEUTIQUES DES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES (TRANSFERT DE GENE)

3 Un gène ou un fragment d ADN d intérêt a été isolé (d une banque ou d un clonage ou d un séquençage de génome, ) : Qu est il possible de faire avec ce fragment? OBJECTIFS : Donner une idée sur les outils de Biologie Moléculaire qui peuvent être utilisés pour étudier l ADN (dans ce cours polymorphismes et diagnostic principalement) APPLICATIONS OUTILS DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE - Large champs d applications : Diagnostic, thérapie génique, agroalimentaire, clonage..) - Applicables à tout type cellulaire Avancées très rapides des techniques. -Cependant, peu d outils de base: Séquençage Hybridations moléculaires (Southern blot) - PCR

4 Les polymorphismes (micro- et macrolésions) peuvent être exploités par séquençage, Southern blot et PCR (à la fois par méthodes de base ou dérivées): Mutations ponctuelles (microlésion) - SNP/RFLP Polymorphismes de répétition (macrolésion) - VNTR/STR Délétions/insertion (micro- ou macro-lésions) -Pour explorer et cibler une lésions (génique ou non génique) dans le génome diploïde d individus potentiellement porteurs de cette lésion, il faut disposer d une sonde (Southern blot) ou d amorces (PCR et séquençage) spécifiques de cette lésion. - dans le cas d une exploration de SNP (RFLP ou non) on parle de polymorphisme biallèlique (2 allèles possibles) et uniquement 3 génotypes (N/N, N/M et M/M) peuvent être détectés dans le génome diploïde - dans le cas d une exploration de VNTR ou STR (séquences répétées) on parle de polymorphisme multi-allèlique (n allèles possibles) et nombreux (>n) génotypes peuvent être détectés dans le génome diploïde au sein d individus d une même espèce.

5 Séquençage/PCR/Southern blot permettent (entre autre!): - Analyse organisation génomique d une séquence ADN dans un génome (copie simple, multicopie, localisation chromosomique) - - Clonage de gènes et production de protéines recombinantes (en vue de thérapie ou de production d anticorps pour des études fondamentales sur la fonction de la protéine) - Analyse polymorphismes (SNP, RFLP, de répétition, etc) : *Les polymorphismes (notamment de répétition) seront utilisés pour la discrimination des individus au sein d une même espèce (les empreintes génétiques humaines sont basées sur l analyse d un profil complexe issu de 13STR). *Applications dans l étude des populations (analyse de leur diversité, de leur origine, etc) *Applications à la médecine prédictive grand public * Les polymorphismes responsables (ou associés) à des maladies génétiques serviront pour leur diagnostic.

6 B- APPLICATIONS AU DIAGNOSTIC GENOTYPIQUE Le diagnostic d'un gène anormal Diagnostic direct Diagnostic semi-direct Diagnostic indirect Sonde génique Sonde extragénique

7 Le diagnostic d'un gène anormal 1-la lésion génique responsable de la maladie génétique est connue - Le principe consiste donc à distinguer le gène pathologique de son homologue normal, par la détection de la lésion génomique elle-même (diagnotic génotypique direct) 2-la lésion responsable de la maladie génétique est inconnue mais il existe d autres polymorphismes (RFLP ou séquences répétées) associés à la lésion génique qui est responsable de la maladie -Le principe consistera alors à distinguer le gène pathologique de son homologue normal, non plus par la détection de la lésion génomique elle-même, mais par l étude d un RFLP voisin (intra- ou juxta-génique; quelques kpb) ou d une séquence répétée (STR/VNTR ; éloigné du gène) de celle ci. -la détection d un RFLP associé à la maladie correpond au diagnostic semi-direct (association bi-allélique). Celle d un VNTR/STR correspond au diagnostic indirect (association multi-allélique).

8 B- APPLICATIONS AU DIAGNOSTIC GENOTYPIQUE Diagnostic direct - détection SNP par PCR et séquençage (chez homozygotes) Individu N/N Individu M/M Amplification PCR de La région ou siège la mutation ponctuelle (*) => Mutation ponctuelle correspondant à une substitution T>G (et changement d'acide aminé F en V= faux-sens)

9 B- APPLICATIONS AU DIAGNOSTIC GENOTYPIQUE - détection SNP par PCR et séquençage chez un hétérozygote Diagnostic direct Individu N/M Hétérozygote Amplification PCR de La région ou siège la mutation ponctuelle (*) A/C N/M =>La superposition de 2 pics chez un hétérozygote indique la présence d'un SNP

10 B- APPLICATIONS AU DIAGNOSTIC GENOTYPIQUE - détection délétion (ou insertion) par séquençage Diagnostic direct Exemple de profils dans cas d'une délétion de 2 bases (TG) sur un gène Exemple de délétion (F508del) impliquée dans maladie génétique monogénique (mucoviscidose) =>Superposition de nombreux pics chez hétérozygote

11 B- APPLICATIONS AU DIAGNOSTIC GENOTYPIQUE - Exemples d'utilisation du Southern blot pour détection RFLP (drépanocytose) sonde sonde 2 allèles 3 génotypes RFLP MstII intragénique RFLP HpaI juxtagénique 1- Diag. direct 2- Diag. semi-direct

12 B- APPLICATIONS AU DIAGNOSTIC GENOTYPIQUE - Exemple d'utilisation de PCR-RFLP pour le diagnostic (semi-direct) d'hémophilie A ((SNP de type RFLP) Une mutation dans l intron 18 du gène codant le FVIII engendre la création d un site de restriction BclI (= allèle M ou +) Allèle N(-) haplotypes Allèle M(+) On amplifie cette région par PCR (142pb) Puis on digère les amplimères par BclI

13 B- APPLICATIONS AU DIAGNOSTIC GENOTYPIQUE - Exemple d'utilisation de PCR-RFLP pour le diagnostic (semi-direct) d'hémophilie A (SNP de type RFLP) PCR M/M N/M N/N 142pb 3 génotypes 142pb Digestion BclI des fragments PCR 99pb 43pb Le profil PCR-RFLP indique si l individu porte la mutation BclI du gène codant le FVIII (homozygote ou hétérozygote)

14 B- APPLICATIONS AU DIAGNOSTIC GENOTYPIQUE - Exemple d'utilisation de PCR ou séquençage dans la détermination du nombre de répétition STR (multi-allèlisme) * Analyse de la variabilité d'un seul STR (cas de recherche du nombre de copie dans cas maladie génétique) *Analyse de la variabilité de nombreux STR (cas de recherche d'empreinte génétiques : dérivent de l analyse de 13 STR) 6 tailles de fragment PCR possibles (haplotypes) Nombreux génotypes possibles (multi-allèlique) sur ADN diploïde (ici seuls quelques uns montrés) => Exemple ci-dessus de 8 STR analysés dans une recherche de paternité

15 C- AUTRES APPLICATIONS => Analyse de l organisation génomique d une séquence d'adn dans un génome fragmenté par Southern Blot : *cas où les fragments d'adn sont séparés par électrophorèse

16 C- AUTRES APPLICATIONS => Analyse de l organisation génomique d une séquence d'adn dans un génome fragmenté, par Southern Blot : *cas où les fragments d'adn constituent une banque d'adn (Cf fin du chapitre 4A) Exemple :banque d'adn génomique constituée de 1536 clones (représentatif du génome) où chacun des clones est dupliqué sur une membrane de Nylon hybridation avec une sonde Résultat : donne la localisation du gène étudié dans la banque d'adn

17 C- AUTRES APPLICATIONS => Analyse de l organisation génomique de 2 gènes (issus d'une même famille multigénique) dans un génome fragmenté, par Southern Blot : *cas où les fragments d'adn constituent une banque d'adn (Cf fin du chapitre 4A) sonde C Sonde 1 Sonde C Gene 1 Gene 2 Sonde 1 Sonde 2 Résultats : Les gènes 1 et 2 sont localisés dans les mêmes régions génomiques (organisation génomique en tandem) Sonde 2 Gene 1 Gene 2 145kbp

18 C- AUTRES APPLICATIONS => Analyse de l organisation génomique d une séquence d'adn dans un génome fragmenté, par PCR : *cas où les fragments d'adn constituent une banque d'adn (Cf fin du chapitre 4A) 20 réactions PCR permettent l analyse de 96 clones 8 Réactions PCR sur des mélanges de lignes 12 Réactions PCR sur des mélanges de colonnes

19 C- AUTRES APPLICATIONS => Analyse de l organisation génomique d une séquence d'adn dans un génome fragmenté, par PCR : *cas où les fragments d'adn constituent une banque d'adn (Cf fin du chapitre 4A)

20 C- AUTRES APPLICATIONS => Analyse de l organisation génomique de 2 gènes (issus d'une même famille multigénique) dans un génome fragmenté, par PCR : *cas où les fragments d'adn constituent une banque d'adn (Cf fin du chapitre 4A)

21 C- AUTRES APPLICATIONS => Déchiffrage d'un génome entier par séquençage *les fragments d'adn séquencés constituent des banques d'adn (de grands (vecteur de type BAC) ou petits (vecteur de type Plasmide) fragments)

22 C- AUTRES APPLICATIONS => Déchiffrage d'un génome entier par séquençage *les fragments d'adn séquencés constituent des banques d'adn (de grands ou petits fragments)

23 C- AUTRES APPLICATIONS Analyse de la diversité des génomes au sein d individus d une même espèce par séquençage - identifier les mutations impliquées dans maladies (entre autre) Exemples d Objectifs: - étudier la relation facteurs environnementaux, gènes et maladies - mise au point de kits génétiques pour le grand public («médecine» prédictive ou personnalisée)

24 I- POLYMORPHISMES DU GENOME HUMAIN ET PATHOLOGIE MOLECULAIRE (MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES) II- MECANISMES ET CONSEQUENCES DES MUTATIONS DELETERES A L ORIGINE DES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES III- METHODES D IDENTIFICATION DES MUTATIONS DELETERES A L ORIGINE DES MALADIES GENETIQUES HEREDITAIRES MONOGENIQUES (DIAGNOSTIC GENOTYPIQUE) IV- APPROCHES THERAPEUTIQUES DES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES (TRANSFERT DE GENE) A- LE CLONAGE MOLECULAIRE D UN ADN D INTERET SUR UN VECTEUR - Extraction des acides nucléiques (ADN, ARNm, synthèse d ADNc) - Séparations électrophorétiques (classique ou PFGE) de l ADN et visualisation - Ligature de 2 ADN (dans une stratégie de clonage d un ADN d intérêt sur un vecteur) - Vecteurs de clonage (plasmides, BAC, rétrovirus) - Transformation bactérienne - Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant ( -complémentation) - Banque d ADN B- APPLICATIONS THERAPEUTIQUES LIEES AU TRANSFERT DE GENE - Production de protéines thérapeutiques recombinantes - par des bactéries en fermenteur (tag (His)6 ou GST) - par des animaux ou végétaux transgéniques - Thérapie génique (ADN médicament) - les différentes stratégies (in vivo ou ex vivo) - les vecteurs viraux - les vecteurs non viraux - Clonage reproductif et thérapeutique - Modifications du génome via approche CRISPR-Cas9