Kits d extraction des Acides Nucléiques

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1 Kits d extraction des Acides Nucléiques Guide de Sélection

2 Les progrès des méthodes de détection et quantification basées sur la PCR en temps réel ont contribué significativement à accroitre l'efficience du contrôle qualité dans l industrie alimentaire. Les laboratoires de contrôle travaillent tous les jours avec des analyses de qpcr pour détecter les pathogènes, les microorganismes d altération, les OGM, les allergènes ou pour prévenir des fraudes. Historiquement, les fournisseurs accentuaient beaucoup la performance des kits de détection, oubliant souvent que dans l application agroalimentaire l extraction de l ADN a une importance équivalente à la qualité des résultats. Les méthodes basées sur l ADN, comme par exemple la PCR (polymerase chain reaction), sont hautement spécifiques, reproductibles, sensibles, et caractérisées d un pouvoir hautement discriminatoire, d un temps de traitement rapide et de couts convenants, mais elles sont fortement limitées de la présence d inhibiteurs dans les aliments. Les inhibiteurs de la PCR, comme les polysaccharides et les acides humiques, particulièrement abondantes dans les échantillons alimentaires, ne sont pas complètement éliminés pendant les protocoles d extraction classique et restent en forme de contaminants dans les préparations finales d ADN. Les composants inhibiteurs peuvent interférer avec la réaction à différents niveaux, menant à la diminution et même à l inhibition complète de l ADN polymérase. 2

3 Ceci dit, les méthodes basées sur l ADN sont hautement dépendants des techniques d extraction et de purification de l ADN. En particulier, les échantillons demandent: Des stratégies d extraction et purification rigoureuses qui assurent la récupération efficiente des acides nucléiques et l élimination des nombreux composés inhibant la réaction e PCR. Méthodes d extraction capables de récupérer l ADN fragmenté/dégradé à cause des changements de ph ou de température (cuisine, stérilisation, fumage etc.) auxquels les aliments sont souvent soumis pendant le procès de production. Quand le matériel est hétérogène, la possibilité d extraire à partir d une grande quantité de matériel afin d assurer la représentativité, ce qui est fondamental spécialement quand on cherche des contaminants comme les OGM, les allergènes, et les espèces de viande/légumes non déclarées. 3

4 Les méthodes d analyse basées sur les acides nucléiques et leur standardisation sont le cœur de l R&D et des activités de vente de Generon comme nous visons à devenir le partenaire le plus fiable en ce domaine pour l industrie des aliments et des boissons. ION est le portefeuille des produits d extraction de l ADN développés par Generon pour exploiter au mieux la PCR en temps réel et la PCR Digitale, trois kits avec des profils différents pour offrir au consommateur la solution la plus convenante pour satisfaire les exigences techniques. ION-Liquid FORCE DNA extractor la solution rapide spécifiquement développée pour l extraction brute et rapide de l ADN des bactéries après l enrichissement en milieu de bouillon. ION-Spin DNA Prep One-for-All kit basé sur le CTAB pour l extraction de l ADN à partir de petits échantillons contenant des composés inhibiteurs de la PCR ION-Force DNA extractor FAST kit basé sur le CTAB pour l extraction de l ADN à partir de grands échantillons, quand la représentativité est d importance suprême. Ion-Force DNA Extractor FAST est utilisé au Laboratoire Italien National de Reference pour les OGM car il permet des extractions d ADN reproductibles à partir de matrices sur lesquelles les autres kits en commerce ne sont pas capables de performer, donnant des rendements d ADN médiocres et inégaux. 4

5 Tableau 1 Adaptation des différents kits d extraction pour les applications en aval Analyse OGM Analyse Allergènes Analyse Microbiologie Authenticité Ingrédients ION-Liquid Force DNA extractor ION-Spin DNA Prep One-for-All ION-Force DNA extractor FAST Tableau 2 Caractéristiques techniques des différents kits d extraction Rapidité Versatilité Mesure Echantillon Pureté ION-Liquid Force DNA extractor ION-Spin DNA Prep One-for-All ION-Force DNA extractor FAST 5

6 ION-Liquid Force DNA extractor (EXD008) Il s agit du kit développé par Generon pour extraire l ADN des microorganismes le plus rapidement possible. L extrême facilité d utilisation s adapte parfaitement à l extraction de l ADN à partir du pellet bactérien dérivé du bouillon d enrichissement. L extrait est très brut donc dans le cas où la matrice alimentaire testée contient beaucoup d inhibiteurs de la PCR on suggère d avancer avec ION-Spin DNA Prep One-for-All. Diagramme 1 Flux de travail de ION-Liquid Force DNA extractor Collecter le milieu enrichi Précipiter le culot et éliminer le surnageant Ajouter ION-Liquid Force Vortexer et chauffer Précipiter les débris Diluer l extrait 1:10 Amplifier l ADN 6

7 La procédure d échantillonnage détermine la représentativité d un résultat, alors que la qualité et la quantité des analytes peuvent varier sur la base de la préparation de l échantillon. L échantillonnage et la préparation de l échantillon sont donc des passages cruciaux du processus de détection des contaminants de l ADN. La limite de détection de la méthode analytique dans son ensemble n est pas déterminée de la partie la plus sensible de la procédure, mais de la moindre. Dans la plupart des cas il s agit de la taille de l échantillon. L échantillon doit être représentatif du lot du produit duquel il a été prélevé, le plan d échantillonnage et la taille de l échantillon doivent donc satisfaire des caractéristiques standards qui respectent l homogénéité et la limite jusqu à laquelle le résultat est fiable. 7

8 ION-Force DNA Extractor FAST (EXD001) Il s agit du kit planifié pour maximiser le rendement et la pureté de l ADN extrait à partir de matrices simples ou complexes (riches d inhibiteurs de PCR). Il s agit d un système essentiel pour obtenir des données répétables et reproductibles comme résultats de la détection moléculaire à partir d échantillons contenant des traces minimales d ADN contaminants, grâce aux avantages suivants: APPROCHE 1-4-ALL permet l extraction à partir des matrices végétales ou animales PROTOCOLE FLEXIBLE permet l extraction à partir d unités d échantillon représentatives RECUPERATION D ADN FRAGMENTÉ permet l extraction à partir de matrices traitées DECONTAMINATION PROGRESSIVE permet l élimination des inhibiteurs de la PCR contenus dans les matrices CONFORMITÉ basée sur l extraction au CTAB conformément aux indications ISO Diagramme 2 Flux de travail de ION-Force DNA N-Hexane Elimination des graisses optionnelle CTAB Préparation Echantillon Buffer E Purification Colonne Lavage ADN pour PCR 8

9 Tableau 3 Liste de matrices extraites avec succès en utilisant ION Force DNA Extractor et ION-Spin DNA Prep One-for-All directement ou après l enrichissement di milieu pour les analyses microbiologiques en aval. Graines de céréales et dérivés de meunerie Garnitures Graines de soja et dérivés de transformation Biscuits et Collations Huiles végétaux brutes et raffinés Aliments et feed extrudées Amidon et sucres Aliments lyophilisés Feed et MBMs Aliments à base de soja Lécithine liquide et poudre Saveurs et épices Œufs et dérivés Vinaigrette Légumes Frais Würstel et charcuterie Légumes séchés ou en conserve Miel Fruits confits Intégrateurs alimentaires Jus de fruit Aliments et formules pour bébé Lait liquide et en poudre Ecouvillons Lait, produits laitiers et crèmes glacées Eau et eau usée Viande (crue ou cuite) Pates et préparations pour pates Boissons Sauces à base de tomate Gâteaux et chocolat Textiles 9

10 ION-Spin DNA Prep One-for-All (EXD018) Il s agit d une version miniaturisée du kit parent ION-Force et ils partagent le même flux de travail montré dans le diagramme 2. Ce kit permet les extractions d une toute petite quantité de matériel (jusqu à 1 gramme) mais nécessite d un équipement de laboratoire minimal: un petit bloc chauffant et une microcentrifugeuse. ION-Spin DNA Prep One-for-All est le kit idéal quand on extrait des échantillons microbiologiques à partir de matrices difficiles et offre, comme ION-Force, les avantages suivants: APPROCHE 1-4-ALL permet l extraction à partir de matrices végétales et animales PROTOCOLE FLEXIBLE permet l extraction à partir d unités d échantillonnage représentatives RECUPERATION D ADN FRAGMENTÉ permet l extraction à partir de matrices traitées DECONTAMINATION PROGRESSIVE permet l élimination des inhibiteurs de la PCR contenus dans les matrices CONFORMITÉ basée sur l extraction au CTAB conformément aux indications ISO 10

11 Le succès général des tests basés sur les méthodes moléculaires dépend de l isolation de l ADN. Pour plusieurs raisons les différentes matrices, et aussi les différents échantillons, produisent différentes quantités d ADN extrait par gramme. La quantité d ADN définit la représentativité et aussi la contribution à l erreur d échantillonnage. Il est donc convenant de mesurer la quantité d ADN obtenu après l extraction et de normaliser la quantité d ADN obtenu après l extraction et de normaliser la quantité d ADN chargée dans une réaction moléculaire, car la normalisation: Fournit uniformité dans l analyse Fournit conformité au schéma d échantillonnage Fournit conformité aux procès/analyses validées Améliore la robustesse de l analyse Fournit un plus haut taux de succès Par conséquent, dans le long terme, elle réduit les couts, et sur la moyenne elle peut améliorer le délai d exécution. En effet, même si la qpcr permet une normalisation dedans l analyse, la normalisation des extraits permet d effectuer des analyses semi-quantitatives. Promega Quantus (ACC2037) et le kit associé Quantifluor dsdna (ACC2038) sont les méthodes de choix pour la quantification de l ADN chez Generon. 11

12 Rev.1_ Generon S.p.A. Stradello Aggazzotti,104 Modena marketing@generon.fr