11/11/2016. Identification bactérienne: Milieu de culture. Ce que vous devez savoir à propos du milieu de culture. Ex.

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1 Identification bactérienne: Milieu de culture Ce que vous devez savoir à propos du milieu de culture Quelles sont les sources de C,H,N,O,P,S? Quel est le type de milieu? Quels sont les indicateurs? Quels sont les agents sélectifs? Ce milieu permet à quelle(s) bactérie(s)de croitre? Quelle(s) est(sont) les réactions possibles? Ex. Agar MacConkey Sources de C,H,N,O,P,S? Type de milieu? Indicateurs? Agents sélectifs? Permet la croissance de quelle(s) bactérie(s)? Réactions possibles? Peptone - 17 g Protéose peptone - 3 g Lactose - 10 g Sels biliaires g NaCl - 5 g Rouge neutre g Cristal violet g Agar g 1

2 Identification : Sources de carbones complexes Utilisation de carbones complexes Trop gros afin d être transporté à l intérieur A besoin d enzymes exocellulaires afin d effectuer des dégradations externes Polysaccharides (amidon) Lipides (triglycérides, etc ) Protéines (caséine) Chaine poly nucléotidique (ADN) Sources de carbones complexes: Amidon Milieu utilisé: Gélose d amidon Enzyme détectée: α-amylase Coupe le lien α-1,4 qui lie les monomères de glucose Identification: Iode (halo = digestion d amidon) 2

3 Sources de carbones complexes: Amidon Avant l ajout de l iode Après l ajout de l iode Sources de carbones complexes : Protéines Milieu utilisé: Gélose de lait Enzyme détectée: caséinase (protéase) Clive les liens peptidiques qui relient les acides aminés dans la caséine Identification: Surface claire (halo) sous et aux alentours de la croissance Sources de carbones complexes: Protéines 3

4 Sources de carbones complexes : Acides gras Milieu utilisé: Gélose de «Spirit Blue» Enzyme détectée: lipase Peut dégrader des gras complexes (triglycérides) en acides gras individuels Identification: «Spirit Blue» ((halo) sous et aux alentours de la croissance) Sources de carbones complexes: Acides gras Sources de carbones complexes : ADN Milieu utilisé: Gélose d ADN Enzyme détectée: ADNase Catalyse le clivage hydrolytique des liaisons phosphodiester dans la structure de l ADN Identification: précipité de l ADN polymérisé est opaque, donc la digestion de l ADN est démontrée par un éclaircissement 4

5 Sources de carbones complexes: ADN Identification: tests métaboliques Bouillon de phénol rouge Permet de déterminer la voie métabolique utilisée (oxidation ou fermentation) et la source de carbone optimale Contient des sources de carbones simples: Peptone (protéine acides aminés) Un sucre désiré est ajouté Contient un indicateur de ph Phénol rouge Jaune- ph acide Orange - ph neutre Rouge- ph alcalin Bouillons de phénol rouge Interprétation A. Jaune (acide) + gaz = Fermentation de sucres B. Jaune (acide) pas de gaz = Fermentation de sucres C. Orange (neutre) pas de gaz = Oxydation de sucres D. Rouge (alcalin) pas de gaz = Oxydation de protéines E. Non-inoculé 5

6 TSI Trois sucres et fer (Three Sugars and Iron) Trois sucres Glucose (agent limitant) Sucrose Lactose Protéines Cystéine Indicateur Phénol rouge Tests IMViC Indoles, Méthyle-rouge, Vogues-Proskauer, Citrate (IMViC) Ces quatres tests individuels permettent de faire des séries de déterminations importantes qui se nomment collectivement la série de réactions IMViC La série de réactions IMViC permet la discrimination de bactéries provenant de la famille bactérienne Enterobacteriaceae Tests IMViC : Méthyle-rouge Vogues-Proskauer Test méthyle-rouge : Fermentation avec accumulation d acide : Glucose pyruvate acide lactique et/ou acide acétique + CO 2 Test Vogues-Proskauer Fermentation avec accumulation de butandiol Glucose pyruvate acétoine 2 butandiol + CO

7 Test méthyle-rouge Test d accumulation d acide Sources de carbone: glucose et protéines Indicateur - méthyle rouge; ajouté après la croissance MR +: rouge (ph < 5.2) MR - : jaune (ph > 5.2) Neutre Acide Test Voges-Proskauer Agents réactifs VP: butanediol + -naphthol + KOH + O 2 acétoine VP + = rouge VP - = jaune Résultats attendus du test MR/VP: MR+/VP-; MR-/VP+ MR-/VP- Acide produit Pas d Neutre Acétoine Acétoine Neutral - + Acid Tests IMViC : test d indole Principal Certains microorganismes peuvent métaboliser le tryptophane en ayant recours à la tryptophanase Tryptophane Tryptophanase Indole + acide pyruvique + NH 3 Agents réactifs de Kovac Couleur rouge 7

8 Test IMViC: utilisation du citrate Source de carbone unique Citrate Indicateur Bleu de bromothymol L utilisation du citrate génère des produits finaux alcalins Change de couleur : du vert au bleu Positif Klebsiella, Enterobacter Negatif E. coli Negatif Utilisation d urée Positif Enzyme testée Uréase Indicateur de ph Phénol rouge (devient rose) H 2 N C O + 2 H 2 O CO 2 + H 2 O + 2 NH 3 (NH 4 ) 2 CO 3 H 2 N carbonate Urée d'ammonium Acides aminés (alcalin) Utilisation d urée Phénol rouge 8

9 Essai de l ornithine décarboxylase Détecte l ornithine décarboxylase Catalyse la décarboxylation de l ornithine Produit de la diamine putrescine et du dioxide de carbone (cause des changements alcalins) Indicateur: Bromo Crésol mauve Mauve lorsque le milieu est alcalin ou neutre Jaune lorsque le milieu est acide Essai de décarboxylase d ornithine Gauche: Alcalin avec et sans ornithine Centre: Alcalin avec ornithine, acide sans ornithine Droite: Acide avec et sans ornithine Pente d agar de phénylalanine Détecte la phenylalanine déaminase L acide phényl-pyruvique réagit avec le chlorure ferrique afin de produire une couleur verte. 9

10 Pentes de phénylalanine A B A: Positif pour l acide phénylpyruvique B: Négatif pour l acide phénylpyruvique Pente d agar de lysine Détecte la lysine décarboxylase Surtout utilisée afin de détecter des bactéries classifiées dans le groupe bactérien Enterobacteriaceae (par example, salmonelle) Indicateur: Bromo Crésol mauve Pente d agar de lysine: Bromo Crésol mauve 10

11 Pente d agar de lysine Culot mauve: lysine décarboxylase positive Pente mauve: lysine déamination negative Culot jaune: fermentation glycolitique Pente rouge: lysine déamination positive Précipité noir: déamination sulfurique SIM Production de sulfide d hydrogène, d indole et la motilité (H 2 S, Indole and Motility) Milieu semi-solide Permet de visualiser la motilité Métabolisme de la cystéine Cystéine H 2 S; H 2 S+ FeSO 4 Précipité noir Métabolisme du triptophane (A) Tryptophane Indole + NH 4 + Pyruvate (B) Indole + agent réactif Kovac rouge Non inoculé Non-motile Indole + - H 2 S et motile 11

12 Respiration anaérobique : Nitrate réductase 2 H + Extérieur 2 H + Q Fe-S Fp NADH + H + FADH 2 Intérieur Cyt b Nitrate réductase 2 H + 3 H OH - 3 H 2 O NO H + (N = +5) nitrate Acceptor final d e- NO 2- + H 2 O (N = +3) nitrite Respiration anaérobique : Nitrate réductase (suite ) NO H + + H 2 O + NO - 2 NO, N 2 O, nitrate nitrite NH 2 OH, NH 3, N 2 Étape 1: Test pour le nitrite NO 2- + acide sulfanilique et alpha naphthylamine HNO 2 Nitrate est réduit Production de nitrite rouge Nitrate est réduit en nitrite Nitrite est réduit Pas de nitrite Jaune Nitrate n est pas réduit Pas de nitrite Jaune NO H + + H 2 O + NO - 2 NO, N 2 O, nitrate nitrite NH 2 OH, NH 3, N 2 Étape 2: Test pour détecter la présence de nitrate NO 3- + Zn (s) NO 2 - Nitrate est présent Reduction en nitrite rouge Respiration anaérobique : Nitrate réductase (suite ) Nitrate est absent Nitrite est réduit Jaune 12

13 Test d oxidase: Respiration aérobique Chaine de transport d électrons 2 H + extérieur 2 H + Q Fe-S Fp interieur NADH + H + FADH 2 Cyt b 2 H + 3 H OH - 3 H 2 O H + Cyt o 3 H + + 1/2 O 2 H 2 O Test d oxidase : respiration aérobique phénylènediamine Cytochrome oxydase catalyse la réduction d un accepteur final d électrons, l oxygène. Un donneur artificiel d e-, phénylène-diamine, est utilisé afin de réduire le cytochrome oxidase Si l enzyme est présent, le réactif incolore (dans sa forme réduite) deviendra bleu (état oxidé) Tests différentiels afin de faire l identification de Cocci Gram Positifs 13

14 Hémolyse sanguine Milieu utilisé: Gélose de sang Enzyme détectée: hémolysine Identification: α-hémolyse: Teinte verte, dégradation partielle des globules rouges sanguines β-hémolyse: éclaircissement, dégradation complète des globules rouges sanguines et de l hémoglobine γ-hémolyse: pas d hémolyse Hémolyse sanguine β α γ Catalase Enzyme retrouvée dans la plupart des organismes vivant en présence d oxygène Réduit le péroxide, ceci peut endomager la cellule (radical libre) Première étape afin de faire la discrimination entre : Micrococcaceae (catalase positive) Streptocaccaceae (catalase négative) 14

15 Catalase On ajoute ceci Est-ce que cette bactérie fait ceci? 2H 2 O 2 catalase 2H 2 O + O 2 Détection de bulles Product de respiration Endommage l ADN Ajoute 3% d H 2 O 2 à la croissance bactérienne bulles (O 2 ) Métabolisme aérobique requiert la catalase Autres cocci gram positifs Tests d identification Bile-Esculine Bacitracine, optochine, et sensibilité à la novobiocine Mannitol + sels d Agar Tellurite d Agar ou Agar de Baird Parker Test Pyr Multi Test: Enteropluri-test Tubes de tests métaboliques multiples Utilisation d un inoculum constant Rapide Lecture peut être automatisé Préparations et inconsistances normalisé 15