Technique d hybridation in. situ sur chromosome interphasique et exemples. Hybridation in situ

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1 Hybridation in situ Technique d hybridation in chromosomique interphasique situ sur chromosome interphasique et exemples Hybridation d applications in situ chromosomique interphasique Dr Copie-Bergman et Nadine Martin Département de Pathologie Hôpital Henri Mondor Créteil DES 2007

2 DEFINITION La cytogénétique interphasique est une analyse cytogénétique par hybridation in situ fluorescente (FISH) sur noyaux non mitotiques avec des sondes ADN spécifiques de chromosomes (Cremer et al; 1986).

3 CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE BASES - propriétés d hybridation de l ADN (séquences nucléotidiques complémentaires) révélation du complexe sonde-cible, en règle à l aide de sondes fluorescentes (FISH), ou chromogéniques ou «métallographiques»

4 Technique FISH Principe Sondes Échantillons Méthode

5 PRINCIPE SONDE CIBLE ADN marqué ADN Noyaux A T T C C ADN simple brin Dénaturation Thermique Hybridation spécifique T A A G G ADN simple brin Observation au microscope

6 SONDES UTILISEES POUR TECHNIQUE FISH Sondes commercialisées Directement couplées à un fluorochrome (CY3,TR,FITC) ou marquées à la biotine ou digoxygénine (+2èm couche) 1- Sondes satellites : Sondes DNA de séquences hautement répétées. La cible sur les chromosomes comportent plusieurs centaines ou milliers de répétitions en tandem d'un motif de bases.

7 Classical satellite : répétitions AATGG dans l'hétérochromatine des chr. 1, 9, 15, 16 et Yq distal. Alpha satellite :(sondes centromériques) Répétitions en tandem de 171 pb localisées au niveau des centromères. Beta satellite : Répétitions en tandem 68 pb, sur le bras court (p) du chromosomes 9 et des acrocentriques 13, 14, 15, 21.

8 CENTROMERIQUE Y SUR SUSPENSION DE NOYAUX

9 2- Sondes «PAINTING»: Mélange de multiples sondes de séquences uniques complémentaires d un chromosome cible. S'utilisent sur métaphases en cytogénétique Marqueur chromosomique Translocation

10 3- Sondes spécifiques d'une séquence unique ( un locus) Détection précise de translocation et d'amplification de gènes. Mise en évidence de délétions chromosomiques. Exemple : locus 17q12 Amplification du gène HER2.

11 4-Sondes dites "MAISON" : -Sondes cosmidiques ou BAC: Une séquence précise complémentaire d'un gène d intérêt, est insérée dans un fragment d'adn circulaire ou cosmide. Réplication en grand nombre dans des bactéries. - YAC : chromosome artificiel de levure : Séquence très longues (300 Kb) Nécessitent une préhybridation avec de l'adn humain total pour neutraliser les séquences non spécifiques.

12 Sonde marquée

13 Sondes de fusion Mise en évidence d une translocation Lymphome du Manteau Interprétation de la t (11;14) 14q32 FITC, locus du gène de la chaîne lourde d'immunoglobuline 11q13 Cy3 locus gène Cycline D1 Recouvre tous les points de cassure Noyau de cellule normale Pas de colocalisation Noyau de cellule tumorale Colocalisation vert /rouge

14 Lymphome du Manteau Colocalisation t(11;14)

15 Sonde c-myc «split-signal signal» Profil FF FRV

16 Sonde c-myc split Objectif x40 zoom Lymphome de Burkitt:t (8;14) ou ses variantes t(8;22), t(2;8)

17 TECHNIQUE FISH Empreintes : Echantillons -Tissus frais ou décongelés -Frottis léger sur lames silanées super adhésives -Séchées et fixées au Carnoy (méthanol 3V/Acide acétique1v, +4 C,5 minutes) Rôle du Carnoy : Eliminer les cytoplasmes pour laisser les noyaux nus.

18 Suspension de noyaux : A partir de prélèvement frais ou décongelé -Désagréger dans PBS -Fixer à éthanol 70 % -Décanter -Filtrer surnageant sur membrane. -Fixer au Carnoy -Dépôt de 10 µl de suspension A partir de coupes épaisses de paraffine 3X20 microns -Déparaffiner -Désagréger mécaniquement dans éthanol 50% -Digestion Protéinase K (30 à 37 C) -Rincer PBS,centrifuger,suspendre dans 100 µl PBS -Centrifuger et Fixer au Carnoy,déposer

19 TETRASOMIE 7 DANS TUMEUR UROTHELIALE TETRASOMIE 7 DANS TUMEUR UROTHELIALE SUSPENSION DE NOYAUX (Tissu congelé)

20 Coupes congélation - 6 µm sur lames silanées - Fixer 5 mn au Carnoy froid (méthanol 3V +acide acétique 1V) - Stockées à -20 C - Post-fixées au paraformaldéhyde 4 % dans PBS avant usage Coupes paraffine -fixateur : formol - 3 à 6 µm sur lames silanées - Prétraitement micro-ondes - Digestion protéolytique ++ PRECAUTION: SUR COUPES, LES NOYAUX SONT TRONQUES, avec PERTE DE SIGNAUX Il faut établir des seuils sur tissus normaux

21 CENTROMERIQUE X SUR COUPE PARAFFINE DE PEAU

22 Principales Etapes de la technique Prétraitement pour Coupes paraffines: -Déparaffiner au Xylène -Réhydrater dans série décroissante d Ethanol -Traitement au micro-onde dans un tampon (citrate) Pour rompre les liaisons covalentes de fixation. -Thiocyanate de Sodium 1M 80 C Ou produit de prétraitement commercial.

23 Digestion protéolytique : -Hydrolyser les protéines nucléaires -Favoriser l'accès de la sonde -Pepsine dans HCL ou protéinase K -+/-10mn à 37 C -Conditions à adapter au type d'échantillon -Compromis entre préservation du tissus et pénétration de la sonde

24 Préparation des sondes : -Décongeler quelques minutes -Diluer selon recommandations du fournisseur.(1/10) -Préparer 10 µl par lame dans un milieu d'hybridation (MIX) contenant du 2SSC (Salt Sodium Citrate buffer) et formamide à 50%.

25 Dénaturation : Séparation des deux brins d ADN -Co-dénaturation : Noyaux cibles et sondes dénaturés ensemble -Déshydrater à l éthanol et sécher les lames -Appliquer 10 µl de sonde sur la zone d intérêt -Recouvrir d une lamelle 24X24 -Sceller à la colle -Placer la lame à 82 C pendant 5 minutes.(conditions selon sonde) Plaque chauffante ou Etuve ou Hybridizer.

26 -Dénaturations Séparées : -Technique classique au Bain-Marie -But : préservation des noyaux (tissus fragiles) -Lames mises 2 à 72 C dans formamide à 70%/ 2SSC Puis rincer 2SSC et déshydrater à 4 C. -La sonde dénaturée 5 à 85 C puis placer dans la glace. -Appliquer10 µl de sonde sur la zone d intérêt -Recouvrir d une lamelle 24X24

27 Préhybridation pour les sondes cosmidiques, BAC, YAC -ADN de placenta humain ajouté au milieu d'hybridation -Dénaturation 85 C -Préhybridation 37 C 1H pour neutraliser les séquences non spécifiques de la sonde avant de l appliquer. Hybridation : appariement sonde/cible -Une nuit (16H minimum) en chambre humide ou hybridizer. -Température selon type de sonde -37 C sondes centromériques -45 C sondes pour translocation

28 Rinçages stringents: Rôle : Eliminer les hybridations non spécifiques température % de formamide. concentration en sels (Na) stringence Exemple pour sondes centromériques: 0,4SSC 72 C 2 ou 2 SSC/50% formamide 37 C 2X5

29 Détection: -Par Immunofluorescence directe ou indirecte Sonde couplée à un fluorochrome Sonde-DIG+anti-DIG/FITC Objectif X40 Objectif X100

30 FISH Multi-couleurs Halling et al, Human Path 2007

31 C.I.S.H. Chromogenic in situ Hybridisation Technique indirecte Sonde marquée à la Biotine Liaison avec Streptavidine couplée Péroxydase Chromogène : Diaminobenzidine (DAB) DAB Streptavidine-PER Sonde marquée à la biotine

32 C.I.S.H Chromogenic in situ Hybridisation Sonde HER2 biotinylée +Streptavidine/Per +DAB Pas d'amplification du gène amplification HER2 >10 spots amplification HER2 avec des clusters

33 S.I.S.H Tissu sain : 2 signaux par noyaux Tumeur : amplification du gène Powell et al, Human Pathol, 2007

34 Double marquage du gène HER2 par S.I.S.H et de la protéine HER2 par I.H.C Amplified for HER2 by FISH 3+ immunostaining by IHC. Amplified for HER2 by FISH 1+ immunostaining by IHC. Powell et al, Human Pathol, 2007

35 LECTURE : -Microscope à Fluorescence (100W mini)+3 filtres -Equipé d une caméra et logiciel d acquisition, superposition et traitement d images. -Aspect des noyaux (iodure de propidium ou dapi) -Intensité du signal -Bruit de fond -Comptage des signaux ( 100 à 200 noyaux) -Se fait sur photos de plusieurs champs. -Etablir un seuil de positivité sur tissu normal.

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37 APPLICATIONS Maladies génétiques acquises (+++) Cancérologie

38 I. Anomalies chromosomiques de «nombre» Tumeurs de vessie monosomie du 9p21 polysomies 3, 7 Cancer de la prostate perte du Y, monosomies 10 Lymphome de la zone marginale de type MALT Trisomie 3, 18 Tumeurs mammaires amplification de HER 2

39 Exemple: amplification de l oncogl oncogène ne HER2 et cancer du sein HER2/neu (Human epidermal growth factor receptor 2) = membre d une famille de gènes codant pour des récepteurs transmembranaires de facteurs de croissance (EGFR, HER2, HER3, HER4) Partie intracytoplasmique de HER2 a une activité tyrosine kinase rôle dans la croissance et différenciation cellulaire Amplification de l oncogène HER2 (Chr 17) induit une augmentation de l expression de HER2 à la surface des cellules tumorales de cancer du sein

40 Amplification de l oncogl oncogène ne HER2 et cancer du sein les cancers HER2+ ont un pronostic plus péjoratif que les cancers du sein HER2-: tumeurs de haut grade, métastases ganglionnaires, résistance à certains types de chimiothérapie, récidive. Détermination du statut HER2: FISH et/ou immunohistochimie Applications thérapeutiques: anticorps monoclonal humanisé anti-her2 réservé aux cancers avec amplification de HER2

41 FISH double couleur CEN 17 et HER2

42 C.I.S.H Chromogenic in situ Hybridisation Sonde HER2 biotinylée +Streptavidine/Per +DAB Pas d'amplification du gène amplification HER2 >10 spots amplification HER2 avec des clusters

43 S.I.S.H Tissu sain : 2 signaux par noyaux Tumeur : amplification du gène Powell et al, Human Pathol, 2007

44 Wolff, JCO 2007

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46 II.. Anomalies chromosomiques de structure Délétions (del) 17p13 (locus du gène P53) dans les tumeurs du sein Inversions (inv) 2 cassures suivies d un recollement après inversion du segment chromosomique Duplications (dup) duplication d un segment au sein d un même chromosome

47 Anomalies chromosomiques de structure Isochromosomes 2 bras identiques aux 2 extrémités (2 courts ou 2 longs) Translocations (t) chromosomiques définition=cassure et déplacement d un fragment de chromosome sur un autre chromosome - «spécifiques» de certaines tumeurs - «marqueur» diagnostique et évolutif - exemples: lymphomes - # méthodes de détection dont la FISH

48 EXEMPLES D APPLICATIONS DU FISH DANS LES LYMPHOMES exemple de translocation: t(11;18) et lymphome du manteau Anomalies de structure et/ou de nombre: le lymphome T γδ et l isochromosome 7q déterminer l origine receveur ou donneur d un syndrome lymphoprolifératif dans un contexte de transplantation de moelle ou d organe

49 Lymphome Définition= prolifération tumorale maligne lymphoïde Atteinte privilégiée des organes hématopoïétiques Hétérogénéité histologique d importance clinique et thérapeutique Tumeurs chimiosensibles (globalement 50% de guérison)

50 OUTILS DIAGNOSTIQUES ETUDE MORPHOLOGIQUE IMMUNOHISTOCHIMIE Anticorps, méthodes sensibles MOLECULAIRES Southern Blot PCR In situ hybridization CYTOGENETIQUE

51 Translocations chromosomiques et lymphomes Lymphome Translocation récurrente Gènes Burkitt t(8;14)(q24;q32) t(2;8)(p12;q24) t(8;22)(q24;q11) MYC/IGH IGK/MYC MYC/IGL Folliculaire t(14;18)(q32;q21) BCL2/IGH t(3;14)(q27;q32) BCL6/IGH Manteau t(11;14)(q13;q32) CCND1/IGH Lymphome Diffus à grandes cellules B (LDGCB) Zone marginale de type MALT t(3;14)(q27;q32) t(14;18)(q32;q21) t(11;18)(q21;q21) t(14;18)(q32;q21) t(1;14)(p22;q32) BCL6 BCL2 API2/MALT1 IGH/MALT1 BCL10/IGH Anaplasique t(2;5)(p23;q35) NPM/ALK variants

52 Mise en évidence d une translocation Cytogénétique conventionnelle + cytogénétique moléculaire (FISH) Southern blot PCR ADN FISH mise en évidence de la conséquence d une translocation: - RT-PCR (compétitive, ou quantitative) - IHC (Ex: cycline D1, ALK ) - utile/indispensable au Dc, suivi - choix dépend de réactivité IHC(anticorps, fixateur), congélation - spécificité

53 Exemple 1 Lymphome du manteau et t(11;14)

54 Classification des lymphomes B à petites cellules Lymphome du manteau CD5+, CD10-, CD23-, m+, d-/+ Lymphome de la zone marginale CD5-, CD10-, CD23-, m+, d-/+ Lymphome folliculaire CD5-,, CD10+, CFD+ Follicule lymphoïde

55 Le lymphome du manteau Clinique stade disséminé, atteinte amygdalienne fréquente atteinte digestive (polypose lymphomateuse) mauvais pronostic Morphologie architecture nodulaire ou diffuse lymphocytes de petite taille, monomorphe Phénotype B CD20+, CD5+, CD10-, CD23-, IgD+, Bcl2+ Réseau de cellules folliculaires dendritiques Bcl1+ Cytogénétique t(11;14)(q13;q32)(ccnd1/igh) hyperexpression de la cycline D1 (Bcl1)

56 POLYPOSE LYMPHOMATEUSE

57 Lymphome du manteau

58 Lymphome du manteau CD20 CD5 CD10 BCL2

59 Etude de l hyperexpression de la cycline D1 par immunohistochimie Bcl1 Bcl1

60 Mise en évidence d une translocation t(11;14) (CCND1;IGH) PCR ADN FISH mise en évidence de sa conséquence: - RT-PCR (compétitive, ou quantitative) - IHC (Ex: cycline D1, ALK ) - utile/indispensable au Dc, suivi - choix dépend de réactivité IHC(anticorps, fixateur), congélation - spécificité

61 Etude du réarrangement du gène CCND1 par PCR (ADN) BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT : PCR-based clonality studies PCR analysis of BCL1 gene rearrangements CCND1 gene MTC region (85bp) (~41% of BCL1 breakpoints) IGH gene J H segments 123 kb BCL1/MTC primer J H primer 5' 3' BCL1/MTC GGATAAAGGCGAGGAGCATAA 3' 5' CCAGTGGCAGAGGAGTCCATTC (+57) J H consensus

62 FISH avec une sonde «split» CCND1 Lymphocyte normal

63 Mise en évidence d une translocation t(11;14) par FISH FISH sur chromosomes en métaphases cytogénétique moléculaire FISH interphasique - appositions de cellules tumorales - coupes tissulaires fixées et inclus en paraffine FISH interphasique Sondes «split»

64 Split CCND1

65 Mise en évidence d une translocation t(11;14) (CCND1/IGH) PCR ADN FISH Éventuellement, mise en évidence de sa conséquence: - RT-PCR (compétitive, ou quantitative) -IHC : Bcl1

66 Exemple 2 Lymphome T γδ hépatosplénique Isochromosome 7q

67 LYMPHOMES T γδ hépatospléniques TIA1 CD3 I Wlodarska et al Genes Chromosomes Cancer, 2002

68 i(7q) i(7q) 7p22 7q35 7p15 7q22

69 exemple 3 Déterminer l'origine, donneur ou receveur, d'un syndrome lymphoprolifératif post-transplantation après allogreffe avec un donneur de sexe opposé. (ex: recherche du chromosome Y dans le lymphome d'une femme dont le donneur de greffe est un homme)

70 Mr R...27 ans Diagnostic de SCID à la naissance «SCID» (Severe Combined Immunodeficiency) Groupe d affections héréditaires caractérisées par un blocage de la différenciation des lymphocytes T, un développement anormal des lignées B et NK et plus rarement des lignées myéloïdes mutation homozygote du gène Rag 1 contrôlant la recombinaison spécifique des gènes du TCR et des gènes d Ig Allogreffe géno-identique à l âge d un mois (sœur aînée donneuse) Diagnostic de LNH gastrique à grandes cellules B découvert à l occasion de brûlures gastriques

71 Aspects morphologiques et immunohistochimiques HES CD20 BCL2 Mib1

72 ETUDE EN FISH INTERPHASIQUE (Mr R, 27 ans, déficit immunitaire congénital, greffé allogénique) Tumeur sonde X sonde Y Muqueuse saine

73 Conclusion Applications multiples - identification de certaines tumeurs associées à des translocations spécifiques -origine de la tumeur chez les transplantés - suivi maladie résiduelle Avantages - possibilité de travailler sur des prélèvements frais ou inclus en paraffine Limites - temps de préparation des échantillons et d hybridation (O/N) - difficultés d interprétation quand la préservation des échantillons n est pas optimum (mode de fixation, mauvaise congélation ) - coût des sondes +++ équipement (microscope à fluorescence)

74 Fishing is possible!