L'hybridation fluorescente (FISH)

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1 L'hybridation fluorescente (FISH) fluorescent in situ hybridization DR Thierry PALUKU THEY-THEY LABO GENETIQUE ET PATHO MOLECULAIRE JUIN 2007

2 Définition repérer la présence d'anomalies chromosomiques par un système couplé anticorps-fluorophore Les sondes L'hybridation La révélation L'observation :

3 Les sondes un brin d'adn comportant des nucléotides modifiés, à partir d'un brin matrice de départ. polymériser le brin complémentaire entre des hexamères de monobrin (brins composés de six nucléotides aléatoires) N : brin complémentaire synthétise entre l'hexamère 1 et l'hexamère 2 M: brin matrice En rose : les nucléotides marqués

4 trois types principaux de sondes séquences uniques: identification d une séquence spécifique séquences multiples: spécifiques à un chromosome entier. ADN α-satellite: identification de séquences au niveau du centromère du chromosome. Les sondes marquées : la biotine révélée par l'avidine, la digoxygénine révélée par un anticorps anti-digoxygénine, les deux couplés à un fluorochrome

5 Le principe L'ADN cible parmi l'adn cellulaire Dénaturation de l'adn cellulaire par chauffage Une sonde d'adn complémentaire de l'adn cible et munie d'une molécule de reconnaissance (R). Hybridation de la sonde et de la séquence cible. Révélation par reconnaissance de la molécule R par un anticorps anti R muni d'un fluorophore F. L'observation au microscope à fluorescence permet de visualiser la présence de la séquence cible.

6 La révélation système biotine-avidine: reconnaître les sondes par des anticorps flanqués de sites moléculaires fluorescent, biotine liée de streptavidine possédant un site fluorescent, elles-mêmes reconnues par des anticorps anti-avidine "équipés" d'un site biotine et d'un site fluorescent (ou fluorophore). M : brin d' ADN matrice dénaturé, H : séquence sonde hybridée.

7 L'observation microscope à fluorescence, la lumière émise par les sites fluorescent : sites hybridés.

8 INDICATIONS Diagnostic de la trisomie 21 Individu A Individu B Une sonde pour identifier le chromosome 13 (vert), une sonde pour identifier le chromosome 21 (rouge)

9 TECHNIQUE DE DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE L amniocentèse :dépister les anomalies chromosomiques L analyse FISH : pas de culture cellulaire. s applique directement aux cellules du liquide amniotique. fréquence anomalies chromosomiques: Les trisomies des chrom 21,13, 18, X et Y représentant 70% des anomalies. Ce test dépiste la trisomie 21, la trisomie 13 et la trisomie 18 ainsi que les anomalies de nombre des chromosomes sexuels (Turner, triple X, Klinefelter, Double Y).

10 DIAGNOSTIC PRENATAL L analyse fiabilité: 99,9% Le taux de réussite technique: 97% anomalies numériques des chromosomes 21, 18, 13, X, Y. 3 causes principales des échecs : le nombre de noyaux est trop faible; les noyaux sont d origine maternelle un problème technique lors de la manipulation.

11 Diagnostic d'une translocation équilibrée. un chromosome ou un fragment de chromosome se soude à un autre chromosome. translocation équilibrée :phénotype de l'individu est normal : il n'y a alors ni perte, ni gain de matériel génétique ex: translocation équilibrée entre les chromosomes 11 et 12 Une sonde du chromosome 11 (rose); une sonde caractéristique du chromosome 12 (vert)

12 Diagnostic d'une délétion Une délétion : perte d'un fragment de chromosome. ex : sd de Di George: anomalies thymiques, cardiaques,hormonaux et psychiques individu normal individu malade

13 Les deux caryotypes après la technique du FISH Individu normal individu malade Marquage de l'extrémité du chromosome 22 sonde associée à un marqueur vert; marquage de la zone absente après délétion, avec une sonde associée à un marqueur rouge

14 Étude de cellules malignes marquage avec un mélange de plusieurs sondes chacune associée à un fluorophore différent permet une "peinture des chromosomes". Exemple : étude chromosomique d'une cellule cancéreuse du foie chez l'homme. a: après révélation; b: après traitement à l'ordinateur cellules malignes : nombreuses anomalies chromosomiques

15 Limites du test Le FISH : 70% des anomalies en moins de 48 heures. Ce test ne dépiste que les anomalies des chromosomes; ne dépiste pas les anomalies des gènes des chromosomes. recourir à un conseil génétique qui permettra d envisager le diagnostic prénatal souhaitable lors de maladie génétique due à une mutation génique.

16 CARYOTYPE Le caryotype(ou caryogramme): arrangement standard de l'ensemble des chromosomes d'une cellule. Les chromosomes sont photographiés et disposés selon un format standard : par paire et classés par taille. but : détecter des aberrations chromosomiques (comme la trisomie 21) ou d'identifier certains aspects du génome de l'individu, comme le sexe (XX ou XY).

17 Caryotype d'un individu de sexe masculin (XY)