Cartographie génomique comparée chez les mammifères G. Bronner, B. Spataro, C. Gautier

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1 Cartographie génomique comparée chez les mammifères G. Bronner, B. Spataro, C. Gautier Introduction La cartographie comparée est une analyse comparative, elle repose donc sur l'exploitation de la biodiversité dans le double objectif de comprendre le fonctionnement des structures biologiques et d'en inférer l'évolution. Cependant la popularité actuelle de cette approche relève d'une autre démarche, plus technique, qui résulte de la structure très particulière des connaissances actuelles sur les génomes. Le coût expérimental de l'analyse d'un génome reste très lourd, ceci implique que les informations disponibles sont concentrées sur quelques organismes "modèles" (principalement homme et souris chez les mammifères). Des mécanismes permettant d'inférer des informations sur des organismes d'intérêts à partir d'organismes modèles sont donc particulièrement précieux, la cartographie comparée entre dans ce cadre. Il faut enfin remarquer que les comparaisons entre génomes peuvent être plus complexes pour profiter des possibilités expérimentales offertes par certaines espèces. Ainsi, bien que l'homme soit un des organisme le mieux connu, la cartographie comparée est largement utilisée pour permettre des aller-retour entre l'information génomique humaine et celle d'autres organismes dans lesquels l'observation, voire l'expérimentation génétique, est plus simple. Cartographie d'un génome La cartographie génomique peut être définie comme l identification de la position de tout élément du génome pouvant être caractérisé de façon non ambiguë. Ces éléments, les marqueurs, sont très divers : simple fragment d'adn sans caractérisation fonctionnelle (segments anonymes), éléments répétés (microsatellites en particulier), gènes. La nature du positionnement des marqueurs et la définition de la distance entre ceux-ci conduit à l'existence de plusieurs types de cartes, schématiquement présentés ici en trois groupes: 1) les cartes génétiques reposent sur l'existence de crossing-over durant la méiose et sur les recombinaisons qu'ils impliquent. Lorsque deux marqueurs sont suffisamment voisins la probabilité d'une recombinaison entre eux se comporte comme une distance et permet ainsi la construction de cartes des chromosomes. Ces cartes résultent donc de la prise en compte d'un mécanisme biologique, ceci n'est pas réellement le cas pour les autres cartes. 2) de nombreuses cartes sont construites à partir de l'appartenance de marqueurs à un même segment génomique. Différentes approches expérimentales permettent de découper les génomes en segments soit en les marquant (coloration des chromosomes en bandes) soit en fragmentant réellement (hybride, hybride d'irradiation, banques). Des techniques reposant sur l'hybridation entre acides nucléiques permettent de repérer l'appartenance de marqueurs à un segment. Dans le cas de la fragmentation du génome les segments sont le plus souvent recouvrant ce qui permet d'affiner le positionnement des marqueurs. Dans ce groupe de cartes, celles utilisant la coloration en bandes des chromosomes occupent une place à part à la fois car elles sont les plus anciennes et par le fait qu'elles mettent en jeu une propriété des chromosomes même si la signification biologique de cette propriété soit loin d'être claire. 3) La séquence complète du génome constitue en elle même un carte particulière, la plus fine possible. 1

2 Ces différentes cartes ne sont pas interchangeables car pour la plupart elles reposent sur des notions de distances différentes. L'ensemble des cartes utilisant directement (séquence) ou indirectement (hybride, hybride d'irradiation, banques) une distance correspondant au nombre de bases séparant deux marqueurs constitue les cartes physiques. Les relations entre cartes physiques et génétiques sont difficiles à établir en particulier par le faits que les marqueurs utilisés ne sont pas en général de même nature. Les cartes physiques contiennent en effet une majorité de marqueurs uniques et conservés tels que des gènes par exemple. En revanche, l'établissement des cartes génétiques nécessite l'utilisation de marqueurs hautement polymorphes comme les microsatellites. Les graphes de Marey (fig. 1) montrent la non proportionnalité des distances physique et génétique mettant en lumière l'existence de régions génomiques ayant des taux de recombinaison plus ou moins élevés. Cette dernière remarque conduit à associer aux cartes une variabilité du paysage génomique en fonction de régions de tailles diverses. Les plus connues de ces régions sont les isochores caractérisés par la variabilité de critères divers: structure des gènes, densité en gènes, nature des éléments répétés, fréquences des bases[1,2]. Comparaison entre cartes de génomes de différentes espèces Pour réaliser une analyse comparative il faut à la fois qu'une diversité existe dans les structures étudiées et que cette diversité n'excède pas un seuil au delà duquel les structures biologiques n'ont plus de points communs. Le mécanisme évolutif clef pour la cartographie comparée est le réarrangement chromosomique. A différentes échelles des segments d'adn sont déplacés soit de manière locale (modification de l'ordre des gènes) soit à l'échelle des chromosomes eux-mêmes (translocations,...). La première étude évolutive systématique de ces modifications à fait l'objet d'un numéro spécial de Mammalia en 1986 [3]. Basée sur la comparaison des chromosomes et l'estimation par comparaison de leur banding des évènements de réarrangement, cette étude a clairement montré la pertinence phylogénétique de la cartographie comparée. Ce travail pionnier a été suivi de nombreuses études sur l'évolution de l'organisation des gènomes qui ont intégrés d'autres types de données (voir en particulier [4,5]). La comparaison des "paysages" génomiques est également apparue fructueuse. Malgré les remaniements importants subis par les génomes au cours de l'évolution, le contexte génomique des gènes reste largement conservé au sein des mammifères. La classe d'isochore d'un gène est ainsi, sauf rare exception, conservée au sein des mammifères, et même au delà dans la majeur partie des vertébrés. De plus l'établissement de liens entre les cartes de deux organismes permet l'étude de la régionalisation de paramètres évolutifs. Ainsi on peut démontrer que des gènes voisins dans les cartes de l'homme et de la souris présentent des similarité de vitesse de substitutions silencieuses: schématiquement la vitesse d'évolution d'un gène dépend de sa position dans le génome. De manière encore plus globale on peut comparer la longueur totale des génomes. Si la distance physique présente peu de différences, il n'en est pas de même de la distance génétique. L'analyse de ces différences a conduit à deux classes d'hypothèses très différentes. Le facteur le mieux corrélé avec la longueur génétique d'un génome est le nombre total de bras chromosomiques (R 2 =0.79, voir pour une revue), ceci plaide en faveur de la nécessité d'au moins un chiasma par bras pour permettre une disjonction correcte des chromosomes lors de la méiose. Cependant d'autres auteurs ont remarqué une forte corrélation avec l'âge à la première reproduction des espèces, suggérant ainsi un facteur sélectionné pour permettre une variabilité génétique suffisante pour des espèces ayant un temps de génération élevé. On retrouve ici un débat classique concernant l'évolution des structures génomique qui peuvent résulter soit d'une sélection sur la fitness des organismes, soit du fonctionnement même de la machinerie cellulaire. 2

3 Ces quelques résultats concernant le fonctionnement global du génome ne doivent pas cacher le fait que les efforts portent essentiellement sur l'utilisation de la cartographie à la localisation et à l'interprétation fonctionnelle de l'information génétique. L'approche expérimentale permettant de comparer les cartes génomiques d'espèces différentes repose largement sur la similarité entre des séquences homologues et donc les possibilités d'hybridations entre séquences des deux génomes. L'approche la plus globale consiste après marquage fluorescent à hybrider des fragments d'un chromosome d'une espèce avec le génome complet de la deuxième, générant ainsi une "peinture" de ce dernier avec les zones similaires, et donc supposées homologues du chromosome sonde. Ce zoo-fish permet l'obtention rapide des synténies entre espèces, une des représentations schématiques classiques est constituée des grilles d'oxford (fig. 2). Ces études présentes deux difficultés d'une part leur relative imprécision, les extrémités des segments génomiques "colorés" par une sonde sont mal définis et d'autre part elle sont insensibles à des modifications locales des cartes, par exemples des inversions courtes. L'identification de marqueurs orthologues entre cartes permet un ancrage plus précis. Une des difficultés résulte de la nature même des processus évolutifs qui combinent l'accumulation de différences le long des branches de l'arbre phylogénétique des espèces avec des duplications des gènes. Une similarité de séquences entre marqueurs, en particulier des gènes, peut donc se produire entre des régions dupliquées (paralogie). La discrimination entre les orthologies (pas de duplication dans l'histoire évolutive reliant les deux gènes) et les paralogies est difficile, l'approche la plus efficace consiste en la reconstruction de la phylogénie de la famille de gènes impliqués (par exemple avec la base Hovergen On peut alors construire les correspondances entre des cartes, éventuellement de type différents, entre espèces différentes. La figure 2 illustre cette possibilité en présentant une correspondance entre la carte génomique humaine déduite de la séquence et les synténies chez la souris. Les données actuellement disponibles impliquent pour la plupart l'homme et/ou la souris d'une part et d'autre part des mammifères soit économiquement intéressants (porc, bœuf, mouton, porc) soit des mammifères qui offrent des possibilités dans la recherche de gènes candidats à des maladies génétiques humaines. Dans ce dernier cadre on trouve en particulier les animaux dits compagnons (chien, chat, cheval) qui ont été soumis à une sélection diversifiante très forte conduisant à l'existence de races fortement homozygotes dans lesquelles peuvent s'exprimer des gènes récessifs. La démarche classique en agronomie consiste à localiser génétiquement des gènes intervenant pour des traits quantitatifs économiquement intéressants (QTL), à associer à la région génomique obtenue la région homologue chez l'homme et à utiliser les connaissances (séquences, EST,...) pour déterminer des gènes candidats. Un exemple typique de cette démarche est fourni par le travail sur la détermination d'un gène (RN) impliqué dans la qualité de la viande de porc [7]. Dans le cas des animaux compagnons la cartographie comparée peut aider à associer aux gènes impliqués dans des maladies génétiques du chien leur homologues humains (voir la très complète revue sur le chien dans [8] et l'article de Lyons LA dans [10] ). Bioinformatique et cartographie comparée La bioinformatique en cartographie génomique présente deux axes de recherche l'un concernant la représentation des connaissances et l'autre l'analyse des données. Représentation des connaissances: L'accès aux données est largement facilité par l'utilisation du Web. Le tableau 1 donne quelques points d'accès avec des indications sur l'état des connaissances pour chacun des 3

4 génomes. Il faut ajouter à ce tableau des sites plus généralistes en particulier celui du Roslin Bioinformatics Group qui offre, avec la base ArkDB, l'accès aux cartes d'une dizaine d'organismes de rente ( ). Ces bases peuvent être interrogées sur le réseau au travers de formulaires de requêtes par le biais de navigateur Web. Dans la plupart des cas, ces formulaires permettent de réaliser des requêtes sur des critères génomiques ou cartographiques. De telles interrogations permettent d obtenir des listes d éléments biologiques répondant aux critères précisés, un lien hypertexte permettant l accès à la description détaillée des éléments individuels. L exploration d informations complémentaires se fait par l intermédiaire de liens hypertextes qui permettent de naviguer à travers le réseau pour atteindre les bases de données appropriées (séquences, homologies etc.). Les données cartographiques sont disponibles sous forme textuelle, graphique avec des images (dont les légendes peuvent être des liens), ou au travers d outils de visualisation spécifiques (MapViewer pour GDB, Anubis pour ArkDB, un applet est également proposé pour l'accès à la MGD : La plupart des bases de données publiques distribuent leurs données sur leur site ftp par le biais de fichiers plats, basés sur une structure de données de type entrées/enregistrement. Ce type d accès permet d avoir des jeux de données permettant la réalisation d analyses à l échelle des génomes, par contre, les données sont assez peu organisées parce qu éclatées dans de nombreux fichiers. Dans les faits, les bases de données dédiées à la cartographie comparée des génomes sont rares. On peut citer la Animal Genome Database of Japan ( qui permet de naviguer au sein des cartes génomiques de différentes espèces de mammifères, la base de données ArkDB pour la génomique comparative qui, même si elle n est pas conçue pour permettre la comparaison de cartes propose une intégration au sein d une structure commune de données génomiques pour différentes espèces de vertébrés. La MGD consacrée à la souris permet la visualisation sur des cartes et sous forme de grilles d'oxford, des homologies avec d'autres mammifères ( Enfin l INRA propose des outils de comparaison impliquant les génomes d'organismes de rente ( Alors que la gestion des données des génomes d invertébrés (D. melanogaster, C. elegans) ou des plantes (A. thaliana) utilisent largement le système de gestion de données génomiques ACEDB ( basé sur un modèle à objets, la majorité des base de données dédiées à la cartographie génomique des vertébrés (GDB, MGD, BOV-PIG- MAP, ArkDB) sont relationnelles (il faut cependant noter la base consacrée au génome humain IGD qui utilise également ACeDB Les SGBD qui reposent sur le modèle relationnel offrent à la fois un langage d'interrogation puissant (SQL), des implémentations très fiables et des démarches de construction des bases de données largement validées. Le revers de cette médaille est que le modèle mathématique sous-jacent est relativement pauvre et ne permet pas la modélisation de structures complexes. Les protéines, les séquences, les cartes et les citations de la littérature forment un corps de données cohérent dont la complexité des interrelations doit être explicité au même titre que les entités du domaine elles mêmes. Les systèmes de gestion de données à objets sont particulièrement adaptés à la représentation des concepts biologiques dans la mesure ou les objets informatiques permettent de modéliser par une représentation relativement intuitive les entités biologiques (gènes, séquences, espèces etc.). La figure 3 présente un fragment de la modélisation du système GEM que nous développons. Cette modélisation utilise UML (Unified Modeling Language, et fait jouer un rôle central au relations entre les entités biologiques. Ce système, implémenté en utilisant le langage AROM ( vise de plus à permettre de 4

5 séparer un module central d'interfaces pouvant être facilement implémentées en fonction de l'objectif poursuivi. Analyse des données: L'analyse des données de cartographies va faire référence à la fois à des méthodes statistiques relativement classiques et à des développements informatiques originaux sur la comparaison de permutations. La mise en évidence de l'aspect régional de caractéristiques génomiques fait appel à des approches statistiques qui dépendent de la natures même des données. Si des méthodes de corrélation entre séquences voisines ont été longtemps l'approche statistique privilégiée (par exemple dans l'analyse des isochores), la disponibilité de longues séquences, voire de chromosomes entiers, ouvre la possibilité d'utilisation de méthodes qui parcourent ces longues séquences à la recherche de changement de structures statistiques. Actuellement les processus de Markov cachés constituent les méthodes les plus populaires du domaine. Enfin lorsque que les analyses portent sur des gènes des méthodes d'autocorrélation spatiale ont été utilisées[6]. La comparaison de la disposition de marqueurs homologues sur deux cartes renvoie à la comparaison de permutations d'objets. L'objectif est de construire une distance entre ces permutation qui ait un sens en tant que distance évolutive, par exemple qui puisse s'exprimer en termes du nombre d'évènements permettant d'atteindre ces deux permutation à partir d'une même permutation ancêtre commun. De très nombreuses études ont été réalisées dans le cadre de petit génome (bactéries, organelles), une très bonne revue pourra être trouvée dans [10]. L'utilisation de ces méthodes dans le cadre de la cartographie comparée de mammifères reste à développer les données étant encore probablement insuffisante. Cependant il est raisonnable de penser que ces approches pourront rapidement éclairer la variabilité le long du génome des différents mécanismes de réarrangement et aider à les relier à des caractéristiques fonctionnelles du génome. Conclusion les cartes génomique sont des objets biologiques complexes qui positionnent de plusieurs façon sur une même structure spatiale des entités biologiques très différentes (gènes, marqueurs anonymes mais aussi propriétés statistiques, évolutives, structurales). La comparaison des tels objets entre espèces implique la manipulation de concepts très divers et il ne parait plus possible d'échapper à une modélisation informatique permettant une manipulation pertinente de ces données. Des projets sont en cours mais aucun n'a actuellement le degré d'achèvement permettant de tirer au mieux parti des données qui s'accumulent extrêmement rapidement aussi bien dans la connaissances des séquences génomiques, des différentes cartes que des données complémentaires (EST,... ). D'une manière plus générale dans le cadre d'une modélisation intégrée de l'ensemble des connaissances liées aux génomes la cartographie comparée devra jouer un rôle majeur à la fois par les possibilités qu'elle offre de relier information génétique, fonctionnement cellulaire et évolution, que par les mécanismes d'enrichissement des connaissances par transfert entre organismes. 5

6 base espèce adresse WWW Nb de loci Nb de gènes cartographiés cartographiés GDB Homo sapiens MGD Mus musculus Ratmap Rattus sp Bovmap Bos taurus Pigmap Sus scrofa Goatmap Capra hircus Tableau 1: Sites permettant l'accès aux données de cartographies chez les mammifères 6

7 Légendes des figures Figure 1 Graphes de Marey: Les graphes en rouge et en bleu correspondent respectivement à la carte génétique de l'homme et de la femme. Les deux graphes sont très différents d'une droite montrant clairement que les distances physique et génétique ne sont pas proportionnelles. Figure 2 Comparaison Homme/Souris La partie gauche est une grille d'oxford montrant les similitude entre les chromosomes de chacune des deux espèces. La partie droite représente la carte du chromosome 2 de l'homme déduite de la séquence du génome (le coordonnées des gènes en nombre de nucléotides apparaissent dans le cadre de droite). Le panneau de gauche montre le banding du chromosome humain, les gènes orthologues chez la souris sont indiqués par des tirets colorés en fonction du numéro du chromosome murin. Un click sur le panneau de droite permet la correspondance (triangle bleu). La partie droite de la figure est directement obtenue par interrogation du système GEM%. Figure 3 Modélisation des connaissances sur la cartographie comparée Les boites rectangulaires représentent des entités, les boites rondes des relations entre ces entités. L'originalité informatique de ce système résulte du statut des relations qui sont des objets qui doivent être instanciés. Ceci permet d'introduire des informations aux niveaux des relations. Les flèches verticales correspondent à des spécialisations, on voit par exemple différents type de cartes. 7

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