THESE POUR LE DIPLOME DE DOCTEUR EN SCIENCES MEDICALES

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1 UNIVERSITE D ALGER Faculté de Médecine N d ordre... THESE POUR LE DIPLOME DE DOCTEUR EN SCIENCES MEDICALES APPLICATION DE LA CYTOGENETIQUE HEMATOLOGIQUE A L ETUDE DES LEUCEMIES AIGUES Soutenue par : Directeur de thèse : Docteur DJOUADI LAHLOU Khadidja. Professeur Rose-Marie HAMLADJI Maître assistante en hématologie Alger, le 17 Novembre 2004 UNIVERSITE D ALGER

2 Faculté de Médecine THESE POUR LE DIPLOME DE DOCTEUR EN SCIENCES MEDICALES APPLICATION DE LA CYTOGENETIQUE HEMATOLOGIQUE A L ETUDE DES LEUCEMIES AIGUES Soutenue par : Directeur de thèse : Docteur DJOUADI LAHLOU Khadidja. Professeur Rose-Marie HAMLADJI Maître assistante en hématologie 1

3 A mon père et ma mère. A mon mari. A mes enfants En témoignage de mon amour, ma profonde affection et mes sincères sentiments. A mes frères et sœurs. A mes beaux frères et mes belles sœurs A mes neveux et nièces. Qu ils trouvent dans ce travail le témoignage de ma gratitude et ma reconnaissance A mes amis. A mes collègues 2

4 REMERCIMENTS Je remercie le professeur Rose Marie HAMLADJI d avoir accepté de m encadrer, de m avoir accueillie dans son service, et permis de manipuler librement au sein du laboratoire d hématologie du CPMC, Pour sa disponibilité et ses encouragements. Je remercie le professeur F/Z ARDJOUN pour son soutien et ses encouragements. Mes remerciements sont particulièrement adressés au DR HAIRECHE Farida pour son étroite collaboration à la mise au point des techniques de cytogénétique, et pour sa disponibilité permanente. Je remercie toute l équipe médicale, paramédicale et le personnel du laboratoire des services d hématologie de l hôpital central de l armée et du centre Pierre et Marie Curie. Je remercie le PR MARTINE RAPHAEL ainsi que toute l équipe du laboratoire de cytogénétique de l hôpital AVICENNE pour l aide précieuse qu on m a apportée. 3

5 Sommaire INTRODUCTION. PREMIERE PARTIE : données de la littérature. I Bases de la cytogénétique. 1/ Historique première période deuxième période troisieme période quatrième période la cytogénétique hématologique.21 2/ Méthodes d étude des chromosomes Culture cellulaire et établissement d un caryotype Prélèvement Mise en culture Choc hypotonique Les bandes chromosomique Examen des métaphases Autres méthodes Cytogénétique et cytométrie en flux Hybridation in situ en fluorescence ou Fish 26 3/ La nomenclature cytogénétique..27 4/ les anomalies chromosomiques Les anomalies chromosomiques numériques Les anomalies chromosomiques de structure La délétion (figure 3) L isochromosome(fig.4) La translocation (fig. 5).35 4

6 Le chromosome isodicentrique L inversion (fig.6 et 6 bis) Le chromosome en anneau (fig. 7) Le chromosome dicentrique L addition Insertion (fig. 8) Duplication Double minutes Les anomalies chromosomiques constitutionnelles et acquises Les anomalies chromosomiques constitutionnelles Les anomalies chromosomiques acquises Définition cytogénétique de la clonalité Les anomalies chromosomiques acquises primaires et secondaires 41 II /données actuelles sur les anomalies cytogénétiques dans les leucémies aigues / Caractères des anomalies chromosomiques des leucémies aiguës.45 2/ Cytogénétiques des leucémies aiguës lymphoblastiques Ploïdie et anomalies de nombre L hyper diploïdie supérieure à 50 chromosomes [53 à 56] Hyperploïdie Hyperploïdie > 65 chromosomes Les formes tétraploïdes (82-94 chromosomes) L hypoploïdie ( 45 chromosomes) Anomalies de structure des LAL B LAL et chromosome Philadelphie t (9 ; 22) Translocation (1 ; 19) (q 23 - P13) et LAL. Pré B Translocation (4 ; 11) (q 21-q23) LAL de type Burkitt et anomalies en 8q Translocation (5 ; 14) (q31-q 32) Délétion du bras court du chromosome

7 Anomalies du bras court du chromosome Translocation (12 ; 21) q q Anomalies de structure des LAL T Translocation (8 ; 14) (q 24-q11) T (1 ;-4) P13 q / anomalies chromosomiques des LAM Anomalies spécifiques de sous types de leucémie aiguë myéloïde Translocation t (8 ; 21) (q22 q22) : (fig. 12 et 13) Translocation (15 ; 17) q 22, q12, q 2 1 et LAM 3. (Fig. 14 et 15) Inversion du ch. 16 p13 q 22 et LAM4 E0 : (fig16 et 17) Anomalie de la bande 11q Autres anomalies récurrentes au cours des LAM Translocation (8 ; 16) (p 11 ; p13) et LAM5 b Translocation (1 ; 22) p11 p13 et LAM Translocation (6 ; 9) (p 23 q 34) trisomie Translocation t (9 ; 22) (q 34 q11) Réarrangements du Ch.3 inversion (3) (q 21 q26) ou t (3 ; 3) (q21 q 26) Monosomie 7 ou délétion 7q (fig. 21) Monosomie 5 ou délétion au 5 q (fig. 22) Perte du chromosome Y Autres anomalies très rares Applications pratiques La nouvelle classification OMS Classification pronostique 68 III/ Rappel des classifications morphologiques et Immunologiques des leucémies aigues 69 1/ La classification morphologique FAB Les bases de la classification morphologique 70 6

8 1.2. Les Leucémies aiguës myéloïdes (LAM).70 Leucémie mégacaryoblastique M7.73 Leucémie aiguë myéloïde très indifférenciée ou M Les Leucémies Aigues Lymphoblastiques (LAL) / Classification Immunologique / Les bases de la classification immunologique des leucémies aiguës Les principaux marqueurs utilisés Techniques utilisées La technique immuno-enzymatique sur lame Technique de cytométrie en flux Profil phénotypique des leucémies aiguës Les leucémies aiguës lymphoblastiques Sous classification des LAL B Sous classification des LAL T Classification des leucémies aiguës myéloblastiques Les leucémies aigues biphénotypiques Les leucémies aigues indifférenciées Les leucémies aigues inclassables..84 7

9 Etude personnelle. I- Matériel et méthodes 86 1-Patients et critères d inclusion Examens complémentaires Etude cytogénétique Matériel Equipement Réactifs Consommables Milieux et solutions Methodes : Technique de banding chromosomique Prélèvement Mise en culture Blocage des mitoses : obtention des métaphases Choc hypotonique : faire éclater les mitoses Fixation Etalements des culots cellulaires Dénaturation Prise de photos et interprétation Interprétation du caryotype Suivi des patients Etude statistique.94 II. Résultats Etude descriptive des patients leucémies aigues myéloblastiques Caracteristiques cliniques des patients Caractéristiques biologiques Analyse cytogénétique..98 8

10 Analyse des patients avec t (8 ; 21) Caractéristiques des patients avec t (15 ; 17) Caractéristiques des patients avec anomalie non spécifique.107 Trisomie Perte du chromosome Y 107 Monosomie Monosomie 5 et del. 5q 108 caryotype complexe 109 Inversion du chromosomes 16 inv.(16) ou t/dl (16) q 22) Réarrangement 11q Caractéristiques des patients ayant un caryotype normal Corrélation entre les anomalies cytogénétiques et la Classification FAB Corrélation entre les anomalies cytogénétiques spécifiques et la classification immunologique LAM2 avec t (8 ; 21) LAM 3 et t (15 ; 17) Les anomalies non spécifiques Corrélation entre les résultats du caryotype et le pronostic dans les Leucémies aigues myéloblastiques Corrélation entre le groupe à risque et la rémission complète (RC) Corrélation entre les groupes pronostiques et la survie Globale Les leucémies aigues lymphoblastiques Caractéristiques des patients Caractéristiques cliniques Caractéristiques biologiques Etude cytogénétique Anomalies de structure 121 T (9 ; 22) ou chromosome Philadelphie.122 9

11 T(8 ;14)..122 T (1 ; 19) Les anomalies de nombre.123 Hyperdiploidie (47-50 chromosomes) 123 L hypodiploidie (planche IX et X) 124 Patients à caryotype normal Corrélation entre les anomalies cytogénétiques et la classification. FAB Corrélation entre les anomalies cytogénétiques et la classification Immunologique Corrélation entre le caryotype et l évolution des patients Classification des patients en groupe a risque cytogénétique et corrélation avec la RC et la survie 131 CONCLUSION ANNEXES Planches..139 à 149 Tableaux 150 à 152 Figures. 153 à 154 Bibliographie

12 Abréviations. Abl : proto-oncogene c- abelson AcM : Anticorps monoclonal. Add : Addition ADN : Acide desoxyribonucleique AF4 : Facteur de transcription. Ag : Antigène. ALL : Acute lymphoblastic leukemia. Alu : Séquences d ADN transposables de petite taille. ATRA : Acide tout trans retinoique. Bcr : breakpoint cluster region=région de regroupement des points de cassure C : Anomalie constitutionnelle. CALGB : The cancer and leukemia group B. CALLA : Common Acute lymphoblastic leukemia. CD : Cluster de différenciation.=anticorps monoclonal. Cen : Centromère. CIVD : Coagulation intra vasculaire disseminée. CO2 : Dioxyde de carbone. Cyt : cytoplasmique. Del : deletion. Dic : dicentrique. Dmn : double minute. DCD : décédé. Dup : duplication. ETO : gene eight twenty one. EORTC : Groupe européen d oncologie et de radiotherapie. FAB : Franco-Americano Britanique. FISH : hybridation in situe en fluorescence. GB : Globules blancs. GEIL : Groupe d étude immunologique des leucémies. GFCH : Groupe français de cytogénétique hématologique. Hb : hémoglobine. HLA : système majeur d histocompatibilité. 11

13 i : isochromosome. Idic : isodicentrique. IL3 : Interleukine 3 Ins : insertion. Inv.: inversion. ISCN : International system for human cytogenetic nomenclature. KCL : Chlorure de potassium. LA : Leucémie Aigue. LAL : Leucémie aigue lymphoblastique. LAM : Leucémie aigue myéloblastique. LAM4 eos : Leucémie aigue myéloblastique de type 4 a éosinophiles. LAM3v : Leucémie myéloblastique de type M 3 variante. LANL : Leucémie aigue non lymphoblastique. LINE : Séquences d ADN transposables de grande taille. LLC : Leucémie lymphoïde chronique. LMC : Leucémie myéloïde chronique. mb : membranaire. MGG : May Grunwald Giemsa. MIC : Morphlogic,Immunologic and Cytogenetic. MLL : Mixed lineage leukemia. MPO : Myeloperroxydase. NOR : Organisateur nucléolaire. N/P : Rapport Nucleocytoplasmique. OMS : Organisation mondiale de la santé. OP : Oncovin et Prédnisone. P : bras court du chromosome. PCR : polymérase Chain réaction. Ph : chromosome Philadelphie. Plaq : plaquettes. PML : Promyélocyte Leukemia. q : bras long du chromosome. r : chromosome en anneau. RC : Rémission complète. RNA : Acide ribonucléique. RT PCR : transcriptase reverse, polymérase Chain réaction. 12

14 SMD : Syndrome myélodysplasique. SVF: Sérum de veau foetal. SWOG : Southwest oncology group. t : Translocation. TCR : Récepteur T. TDT : Terminal desoxy nucleotidyl transferase. TIWCL : third international workshop on chromosomes in leukemia. 13

15 INTRODUCTION 14

16 Si la classification cytologique et cytochimique du groupe Franco-Américano- Britanique reste déterminante pour la caractérisation des leucémies aiguës, l étude du phénotype immunologique et l examen cytogénétique sont des compléments indispensables pour affiner le diagnostic et apprécier le pronostic de ces hémopathies. L étude du phénotype immunologique permet de distinguer les LAL de la lignée B et T afin d assigner les malades à un protocole thérapeutique approprié. Dans les LAM, il permet d affirmer la nature myéloïde des blastes peu différenciés en particulier dans les LAMo et enfin il permet de poser le diagnostic de LA à phénotype complexe (les leucémies aigues biphénotypiques). L étude cytogénétique des leucémies aiguës, quant à elle, permet la mise en évidence d anomalies chromosomiques acquises et non aléatoires dans 60 à 90% des cas. Ces anomalies sont de mieux en mieux précisées grâce aux progrès de la cytogénétique hématologique, ce qui fait de cet examen un élément clé de l évaluation initiale de tout patient porteur d une leucémie aiguë du fait de ses implications diagnostiques et pronostiques qui conditionnent la prise en charge thérapeutique. Ces progrès importants ont résulté des améliorations techniques (techniques dites de banding usuelles ou de haute résolution et plus récemment l hybridation in situ) et de l identification par de nombreux auteurs ou groupes coopératifs d anomalies cytogénétiques spécifiques d un type ou d un sous type spécifiques de L.A. permettant une meilleurs approche diagnostique et pronostique. Certaines anomalies sont spécifiques et sont corrélées avec la classification FAB et permettent de conforter le diagnostic (ou constituent un apport diagnostic précieux dans certains cas d interprétation cytologique difficile). 15

17 Par ailleurs le caryotype permet l identification d anomalies spécifiques ou non spécifiques qui ont une valeur pronostique souvent indépendante des autres paramètres clinico-biologiques. En plus de l intérêt diagnostic et pronostic, la cytogénétique est à la base de la découverte des gènes impliqués dans les phénomènes de leucémogénèse, et la biologie moléculaire s intègre logiquement à sa suite pour leur compréhension. Ses applications en pratique clinique sont croissantes, qu il s agisse d une détection affinée de certaines translocations ou d appréciation de la maladie résiduelle. Un travail sur les apports des données cytogénétiques en hématologie est déjà réalisé en Algérie, en 1985 par le PR.S.BELLABES, non poursuivi depuis cette date,qui a démontré clairement l intérêt triple de cette étude : diagnostique, pronostique et nosologique.ainsi la réintroduction du caryotype hématologique par la technique dite de banding et son utilisation en pratique courante représente l essentiel de notre travail, dont les objectifs sont les suivants : 1/- Etablir la fréquence des anomalies chromosomiques dans les leucémies aiguës en Algérie en comparaison aux données de la littérature. 2/- Etablir la fréquence des anomalies chromosomiques respectives dans les LAL et les LAM par rapport aux données de la littérature. 3/- Etablir la corrélation entre les différentes anomalies chromosomiques et la classification FAB. 4/- Etablir les corrélations entre les résultats de l étude cytogénétique et celle du phénotype immunologique. 5/ - Etablir les corrélations entre les résultats du caryotype et le pronostic des LAL et des LAM. 16

18 PREMIERE PARTIE DONNEES DE LA LITTERATURE 17

19 І/ LES BASES DE LA CYTOGENETIQUE : L ADN est le constituant génétique essentiel des cellules transmettant l information sous forme codée d une cellule à cellule et d organisme à organisme. A l intérieur des cellules, le DNA n est pas libre mais forme un complexe avec des protéines spécifiques, l ensemble formant la chromatine. Le noyau contient une quantité constante d ADN représentant le matériel génétique. L information génétique reste inchangée durant la différenciation des tissus somatiques. Cette situation est due à un nombre de chromosomes constant dans les cellules somatiques, ce nombre de chromosomes est de 46 (2n). La cytogénétique a pour objet l étude des chromosomes, elle repose essentiellement sur l étude du caryotype. Leur analyse est effectuée au cours d un stade du cycle cellulaire où les chromosomes sont bien individualisés et peuvent être observés au microscope. C est le plus souvent la métaphase mitotique qui est observée mais l étude de la méiose est également possible et, plus récemment, grâce à des techniques d hybridation in situ utilisant des sondes d ADN non radioactives s est développée celle des noyaux en interphase. 1/ Historique : La cytogénétique, pratiquement née avec le vingtième siècle, est une discipline jeune. Les progrès les plus récents ont amené la transformation des méthodes et l élargissement des applications. La connaissance de l organisation des chromosomes a permis de rendre compte des particularités et des variations de l ADN constitutif. A l heure actuelle, l apport cytogénétique est devenu indispensable à plusieurs pathologies humaines. Il y a de nombreuses façons d approcher la cytogénétique humaine. HSU. TC (1) définit 4 périodes : La première période : ou «âge des ténèbres de la cytogénétique humaine» débute par le travail d un cytologiste D. Von Hanseman 18

20 qui en 1891 dénombre le premier 18, 24 et plus de 40 chromosomes dans les 3 cellules de tissu humain normal. Ces premières observations donnent lieu à des estimations contradictoires du nombre somatique normal à 48 chromosomes. Tous les auteurs ont utilisé des techniques d histologie classique sur des prélèvements post-mortem de testicule humain. Les comptages des chromosomes étaient difficiles par la superposition des images et la perte d un ou plusieurs chromosomes. En 1912, Winiwarter améliore cette technique en prenant des biopsies de testicules prélevés chirurgicalement, immédiatement fixées et coupées à une épaisseur de 5 et 7,5mm qui permettent de garder intact l ensemble de la garniture chromosomique. A la suite de ces améliorations techniques, Winiwarter conclut à la présence de 47 chromosomes dans les spermatogonies (46A + X) et de 48 (46 + X+ X) dans les ovogonies et à un mécanisme du déterminisme du sexe à XX XO. Le chromosome Y est décrit plus tard par Painter (1921, 1922) comme un élément petit et non apparié et conclut en 1923 à l existence de 46 + X + Y pour l homme et à 46 + X + X pour la femme et à un mécanisme du déterminisme du sexe liée à la formule XX ou XY (Painter 1923) La deuxième période = : Cette période commence avec la découverte fortuite, en 1952, par HSU, du prétraitement par le choc hypotonique des préparations chromosomiques obtenues in vitro à partir de cellules de tissu splénique. Cette nouvelle technique favorise le gonflement cellulaire, la dispersion des chromosomes et permet une meilleure individualisation de ceux-ci. A la suite de cette découverte deux cytologistes Albert Levan et Joe Hir Tjio, en 1956 déterminent le nombre de 46 chromosomes dans les cellules somatiques humaines. Cette découverte est à la base de l étude systématique du caryotype humain. 19

21 1.3- La troisième période : Elle commence par la publication le 26 Janvier 1959 par Lejeune, Gauthier et Turpin dans les comptes rendus de l académie des sciences de Paris de la présence chez neuf enfants Mongoliens d un petit chromosome acrocentrique surnuméraire. Cette découverte marque la naissance de la «cytogénétique clinique». Depuis cette date, l importance diagnostique de la cytogénétique n a cessé de croître. Un effort collectif des cytogénéticiens et des cliniciens pour rechercher dans les anomalies congénitales une éventuelle étiologie chromosomique fait suite à cette découverte. Rapidement différentes anomalies de nombre et de structure chromosomique sont décrites. En 1960, Peter Nowell à l idée d utiliser la phytohémaglutinine pour l étude des cellules sanguines. Cette substance capable d une action mitogène sur les lymphocytes induit leur transformation blastique et dès lors, permet l étude du caryotype à partir d un simple prélèvement de quelques millilitres de sang périphérique La quatrième période : après 1969 Est celle du banding chromosomique. La première technique de banding est due à Caspersson, (2) qui utilise la moutarde de quinacrine pour individualiser chaque chromosome par l apparition de bandes caractéristiques : Les bandes Q : Capersson 1969, D autres techniques sont rapidement mises au point : Le banding G : Seabright 1971(3), le banding R : Dutrillaux et Lejeune 1971(4), le banding C : Summer et al. 1971, le banding NOR : Howell et al La découverte des bandes chromosomiques va améliorer considérablement les potentialités d analyses et permet la reconnaissance plus aisée des anomalies chromosomiques. 20

22 Actuellement la cytogénétique apparaît comme une science à part entière. Plusieurs spécialités se sont développées (1) : 1/ Etudes des anomalies chromosomiques constitutionnelles. 2/ Dépistage anténatal des aberrations chromosomiques. 3/ Analyse des anomalies chromosomiques acquises présentes dans les cancers et les leucémies ou consécutives à l exposition aux radiations ionisantes à des substances toxiques ou des agents mutagènes. 4/ Localisation des gènes ou de segment d ADN sur les chromosomes, ayant pour objectif d établir une carte chromosomique du génome humain La cytogénétique hématologique L apport de la cytogénétique au domaine de la cancérologie reste très important. Dès 1914 Boveri avait avancé l hypothèse que des changements dans la constitution chromosomique constituaient un prérequis à l apparition d un cancer. Nowell et Hunger Ford en 1960 découvrent le chromosome Philadelphie ou t (9 ; 22) et montrent qu une translocation spontanée peut survenir entre deux chromosomes de façon indépendante et répétée (6). La définition de plus en plus précise des anomalies chromosomiques, le rôle diagnostique et pronostique du caryotype des cellules leucémiques, rendent compte de l intérêt croissant que connaît la cytogénétique hématologique. L amélioration progressive des techniques mises en œuvre telle que les cultures à court terme, l utilisation systématique des techniques de bande, l introduction des bandes de haute résolution et les corrélations avec la biologie moléculaire ont été des facteurs essentiels de ce développement (7). Clonales ou acquises, les anomalies chromosomiques des leucémies ont vu reconnaître leur caractère non aléatoire et pour certains leur spécificités vis à vis d un type donné de prolifération, on distingue actuellement les anomalies primaires qui font partie de la chaîne des évènements 21

23 leucémogènes et les anomalies secondaires qui témoignent de l évolution clonale de la leucémie (7). La convergence récente des résultats de la cytogénétique et de la biologie moléculaire a provoqué une véritable révolution pour notre compréhension des mécanismes de l'oncogenèse. Les remaniements pathologiques des gènes d Immunoglobulines dans les leucémies aiguës lymphoblastiques B (7, 8, 9) et la définition moléculaire du chromosome Philadelphie ont démontré qu un remaniement chromosomique visible au microscope optique correspondait à un remaniement génétique impliquant des gènes précis souvent actifs (7, 10, 11). Les données de la cytogénétique moléculaire sont désormais des arguments essentiels pour le rôle des anomalies chromosomiques acquises dans la cancérogenèse. Pour le clinicien la fonction du caryotype des leucémies est double : diagnostique, car le caryotype permet de classer les leucémies aiguës en variétés homogènes et pronostique car le caryotype s est affirmé comme un indicateur de premier plan du devenir tant des LAL (12) que des LAM (13, 14). Le caryotype des leucémies est de plus en plus souvent pris en compte pour l orientation thérapeutique (15). 2/ Méthodes d étude des chromosomes Deux artifices techniques ont permis le développement initial de la cytogénétique humaine : l emploi d une solution hypotonique pour faire gonfler les cellules (choc hypotonique) et le séchage à l air qui complète l étalement des chromosomes. La mise au point de culture de lymphocytes au début des années 1960, puis des techniques de bande à partir de 1970, a aussi grandement contribué à l essor de la cytogénétique moderne laquelle connaît un renouveau avec l emploi des techniques d hybridation in situ en fluorescence. 22

24 2.1- Culture cellulaire et établissement d un caryotype L examen des chromosomes est habituellement effectué au stade de métaphase. Il est donc nécessaire d obtenir des cellules en division pour en faire l analyse. Tout tissu prélevé stérilement dont les cellules sont capables de se diviser, peut être utilisé à cette fin Prélèvement Le caryotype hématologique se fait à partir d un prélèvement sanguin périphérique s il existe une blastose sanguine ou à partir d un prélèvement de moelle osseuse par une seringue héparinée, qui sera transvasé tout de suite dans un tube conique stérile contenant un milieu de culture fait d un mélange de RPMI et d héparine Mise en culture : Le prélèvement est acheminé aussitôt au laboratoire où une mise en culture est faite : dans un milieu contenant du RPMI, du sérum de veau fœtal, de la L.Glutamine, des antibiotiques et de l héparine. Cette préparation est mise en incubation dans une étuve à CO2 de 24h à 72h selon le type de leucémie aiguë (7), les mitogènes sont peu employés sauf dans des cas particuliers comme les LAL T, car ils peuvent stimuler la division des cellules non malignes. On incube les cellules se multipliant en présence d un poison du fuseau mitotique telle que la colchicine qui, en dépolymérisant la tubuline du fuseau les bloque en métaphase (7) Choc hypotonique : Les cellules sont gonflées par un milieu hypotonique (solution de potassium) ce qui désorganise leur architecture interne. Elles sont ensuite fixées, toujours en suspension, par un mélange alcoolo acétique pour être étalées sur des lames de verre par le dépôt de la suspension cellulaire, le fixateur en s évaporant, provoque la rupture de la membrane cellulaire et l étalement des chromosomes sur le verre (5). L aspect des chromosomes des cellules leucémiques est parfois décevant (ils sont 23

25 frisotés, flous, condensés), en tout cas moins avenant que celui des chromosomes des cellules normales (7) Les bandes chromosomiques : Au début des années 1970 furent mises au point des techniques permettant d obtenir des bandes sur les chromosomes (techniques de banding ou Zebrages) = ces techniques induisent une succession de bandes claires et sombres de topographie spécifique sur tous les chromosomes (5,7). Les principaux types en sont :! Les bandes Q = pour quinacrine = nom du colorant qui nécessite l observation en fluorescence.! Les bandes G = pour Giemsa = nom du colorant utilisé, obtenue après l action de la trypsine mais dont il existe de nombreuses variantes.! Les bandes R colorée au Giemsa après dénaturation à la chaleur montrent une séquence de bande inverse de celle des bandes G et Q sur chaque chromosome.! Les bandes C pour centromère qui marquent les régions péricentromériques et la partie distale du chromosome Y. Les régions marquées par les bandes C correspondant à l hétérochromatine, définie comme un type de chromatine condensée dans le noyau interphasique où elle est colorée plus intensément que la chromatine décondensée ou euchromatine. On peut adjoindre l étude des bandes T où se colorent préférentiellement les régions télomérique des chromosomes. Et enfin les techniques de colorations des satellite ou NOR = organisateur nucleolaire par l imprégnation argentique. 24

26 Après marquage Q, R et G le chromosome présente une alternance de bandes claires et sombre dont la position, la succession, la dimension et l intensité sont caractéristiques de chacun des chromosomes. Grâce à ces techniques, il devenait donc possible non seulement de reconnaître individuellement chacun des chromosomes humains, mais aussi de détecter les remaniements affectant de courts segments chromosomiques (perte d une bande, délétion, ou transfert sur un autre chromosome, translocation) et enfin de localiser précisément les points de cassure sur les chromosomes. La signification biologique des bandes chromosomiques n est pas encore totalement élucidée. Trois éléments ont été particulièrement considérés : La variation de la composition moyenne en base le long de la molécule d ADN, la précocité de la réplication d ADN, la richesse en gène et leur activité :! Les bandes G colorées par le Giemsa sont riches en adénine et thymine, se répliquant tardivement, contiennent relativement peu de gènes et sont riches en séquence LINE (qui sont des éléments d ADN transposables de grande taille) (5).! Les bandes R colorées par le Giemsa sont riches en guanine et cytosine, se répliquant précocement contiennent de nombreux gènes et sont riches en séquence ALU (nom désigné aux séquences d ADN transposable de courte taille) (5) Examen des métaphases L ultime étape de l établissement du caryotype est l examen des métaphases au microscope optique. Ces métaphases sont photographiées et un tirage sur papier est réalisé. Les chromosomes sont découpés et classés selon la nomenclature internationale (17). Le résultat de classement constitue un caryotype. Il existe actuellement des systèmes d analyse d image commercialisés qui permettent l établissement du caryotype à l aide de logiciels adaptés (Lundsteen et Martin 1989) (18). L avantage de ces systèmes est que la photographie n est plus nécessaire puisque l image est directement enregistrée à partir du microscope, néanmoins, le 25

27 classement semi automatique des chromosomes nécessite l intervention de l observateur pour corriger les erreurs de la machine et ne dispense donc pas d une formation sérieuse Autres méthodes : Cytogénétique et cytométrie en flux : La cytométrie en flux est une technique qui permet d analyser les paramètres (taille-fluorescence) caractérisant les cellules en suspension. Appliquée à des préparations de chromosomes en suspension, cette technique a permis d établir le caryotype en flux, en caractérisant individuellement les chromosomes en fonction de leur longueur relative et leur contenu en ADN (5). L évaluation de ce contenu en ADN des cellules leucémiques apparaît actuellement comme une méthode rapide qui permet la définition d un facteur pronostique indépendant dans des analyses multi variées: l index en ADN (20). Il s agit du rapport du contenu modal en ADN de cellules leucémiques en GO/G1 sur celui des cellules normales. Il est étroitement corrélé à la ploïdie (19). Cette technique ne peut cependant évaluer les anomalies de structure comme les translocations (19) Hybridation in situ en fluorescence ou Fish : L hybridation in situ sur chromosome a d abord été développée avec des sondes marquées (radioactives) dans le but de localiser des gènes. Au cours des années 1980, des techniques de FISH (fluorescence in situ hybridation), utilisant des sondes moléculaires associées à des fluorochromes, ont été mises au point. Les sondes peuvent correspondre à des séquences répétées ou uniques d ADN où des insert d ADN génomique de plus grande taille contenus dans différents vecteurs (5). La multiplicité des fluorochromes utilisables offre des moyens nouveaux qui permettent non seulement de localiser des gènes mais aussi d analyser les anomalies de nombre et de structure des chromosomes (5). 3/ La nomenclature cytogénétique : La nomenclature des chromosomes humains a été initialement établie dans une conférence internationale en 1960 (21). Elle a été régulièrement actualisée pour 26

28 inclure les terminologies, pour décrire les anomalies chromosomiques, les bandes chromosomiques, les bandes de haute résolution et plus récemment les résultats de l analyse FISH. La nomenclature la plus récente a été publiée en 1995 (17). L analyse cytogénétique visualise chaque chromosome comme deux chromatides qui sont réunies par un étranglement central appelé centromère. Le centromère est la région où le chromosome est attaché au fuseau pendant la mitose. Le centromère divise le chromosome en 2 bras : un bras court appelé le bras p (p pour petit) et un bras long désigné comme le bras q (q a été choisie simplement parcequ elle est la lettre qui suit la lettre p) (7). Conventionnellement les chromosomes sont toujours représentés avec le bras p en haut. Les chromosomes ont été décrits initialement en fonction de leur taille et de la position du centromère. La taille était caractérisée comme grande, moyenne ou petite. La position du centromère était utilisée pour classer les chromosomes comme médiocentrique, acrocentrique ou submétacentrique. Dans les chromosomes médiocentriques, le centromère est à peu près au milieu du chromosome, de telle sorte que le bras p et le bras q sont grossièrement de longueur égale. Les chromosomes acrocentriques ont un centromère situé à l une des extrémités du chromosome, de telle sorte que le bras p est beaucoup plus court que le bras q. Les chromosomes submétacentriques ou télocentriques ont un centromère qui est en position intermédiaire avec des bras courts qui sont grossièrement la moitié de la longueur des bras longs. En 1963, avant la mise au point du banding chromosomique, les chromosomes humains ont été divisés en sept groupes de A à G basés sur leur taille et la position du centromère (22). Le groupe A comprend les chromosomes 1,2 et 3 qui sont de grands chromosomes métacentriques. Le groupe B comprend les chromosomes 4 et 5, qui sont grands et submétacentriques. 27

29 Le groupe C comprend les chromosomes 6 à 12 et le chromosome X, qui sont de taille moyenne et métacentriques ou submétacentriques. Le groupe D comprend les chromosomes 13 à 15 qui sont des chromosomes acrocentriques de taille moyenne avec les satellites. Le groupe E, les chromosomes 16 à18, comprend le petit chromosome métacentrique le chromosome 16 et les chromosomes submétacentriques 17 et 18. Le groupe F comprend les chromosomes 19 et 20 qui sont petits et métacentriques. Le groupe G inclue les chromosomes 21, 22 et Y qui sont petits et acrocentriques ; les chromosomes 21 et 22 ont des satellites, tandis que le chromosome Y n en possède pas. En l absence du banding chromosomique, les chromosomes au sein de quelques groupes ne peuvent être distingués. Le banding permet d identifier les chromosomes de chaque groupe et de distinguer les uns des autres. La nomenclature a été ensuite établie pour décrire la structure de chaque chromosome. Le terme landmark ou repère est utilisé pour désigner les caractères morphologiques importants qui identifient les chromosomes. Les repères comprennent le centromère, les extrémités des chromosomes (appelées télomères) et les bandes chromosomiques proéminentes. Les régions des chromosomes sont définies comme des aires situées entre des repères adjacents. Le nombre de régions sur les bras courts et longs de chaque chromosome est compris entre 1 et 4. Les régions de chaque bras chromosomique sont comptées à partir du centromère vers le télomère. Les bandes sont définies comme des segments chromosomiques qui sont clairement distinguables des segments adjacents, apparaissent plus clairs ou plus foncés après utilisation de la technique des bandes. Les régions chromosomiques sont divisées en 28

30 bandes. Les bandes à l intérieur des régions sont aussi comptées sur chaque bras du centromère vers le télomère. Pour désigner les bandes chromosomiques, on spécifie le numéro du chromosome, le bras, le numéro de la région et le numéro de la bande au niveau de la région, nommés dans l ordre sans espace, ni ponctuation. Par exemple, 1 p 31(chromosome 1, bras court, région 3, bande 1) désigne la première bande de la 3 ème région du bras court du chromosome 1. Voir Annexe : planche I, II, et III. Le banding de haute résolution divise les bandes chromosomiques en sous bandes, qui sont des régions claires ou sombres constituant des structures plus fines à l intérieur des bandes chromosomiques. Les caryotypes sont décrits suivant le système international de la nomenclature de la cytogénétique humaine (17). La description du caryotype commence par le nombre total de chromosomes incluant les chromosomes sexuels. Le nombre total de chromosomes est suivi par les chromosomes sexuels présents dans la cellule, puis une liste d anomalie des autosomes suivant l ordre numérique ascendant. Ce système représente un changement par rapport à l ancienne nomenclature dans laquelle les anomalies chromosomiques de nombre étaient listées en premier, suivies par les anomalies structurales. Un caryotype mâle est 46, XY (figure 1) et le caryotype femelle normal est 46, XX (figure 2). Les abréviations communes et les symboles utilisés pour décrire les caryotypes sont listés dans le tableau 1. 29

31 Figure 1 : caryotype masculin 46 XY 30

32 Figure 2 : caryotype féminin 46XX 4. les anomalies chromosomiques : Les anomalies chromosomiques peuvent être, des anomalies de nombre ou de structure et peuvent êtres aussi constitutionnelles ou acquises. Le terme anomalie chromosomique numérique définit un caryotype avec un nombre anormal de chromosomes. Les anomalies chromosomiques numériques incluent la perte ou le gain d un chromosome. Les anomalies chromosomiques structurales sont des altérations de la structure de certains chromosomes incluant la perte, le réarrangement ou le gain de segments chromosomiques. Les anomalies chromosomiques numériques et structurales peuvent coexister dans les cellules malignes. 4.1 Les anomalies chromosomiques numériques : Une cellule contenant un nombre normal de chromosomes, de structure normale, est appelée diploïde. Les cellules avec 46 chromosomes, mais avec des anomalies 31

33 chromosomiques numériques (par exemple perte et gain d un autre) ou avec des anomalies de structure sont appelées pseudodiploïdes. La présence d un nombre anormal de chromosomes est appelée aneuploïdie. Les cellules avec plus de 46 chromosomes sont appelées hyperdiploïdes, tandis que la présence de moins de 46 chromosomes est appelée hypodiploïdie. La perte d une copie d un chromosome réalise une monosomie pour ce chromosome. Le gain d une copie pour un chromosome réalise une trisomie pour ce chromosome. Plus rarement un chromosome gagne deux copies additionnelles réalisant une tétrasomie (5). La perte d un chromosome est indiquée sur le caryotype par un signe moins suivi par le chiffre du chromosome intéressé, tandis que le gain d un chromosome est indiqué par le signe plus suivi par le chiffre du chromosome intéressé. Le nombre de chromosomes dans la cellule, donné par le caryotype, reflète ce qu elle a perdu ou gagné. Par exemple, 45, XY,-7 indique une cellule mâle qui a perdu une copie du chromosome 7(monosomie7) ; 47XX, +8 indique une cellule femelle qui a gagné une copie du chromosome8 (trisomie 8) et 48, XY, est une cellule mâle avec deux copies additionnelles du chromosome 13 (tétrasomie 13). Les chromosomes qui sont le plus souvent déficitaires au cours des anomalies cytogénétiques acquises sont le 5, 7, X, et Y (23). La perte du chromosome Y peut être retrouvée dans les cellules médullaires des hommes âgés normaux (39) mais peut être également une anomalie cytogénétique primaire (40) aussi bien qu une anomalie secondaire particulièrement au cours de la LAM avec t (8 ;21) (41). La trisomie acquise la plus courante est la trisomie +8, elle est retrouvée dans les LAM, les syndromes myélodysplasiques (MDS) et la LMC en transformation blastique (23). La trisomie 8 dans la LAM apparaît à la fois comme une anomalie cytogénétique primaire ou secondaire. D autres trisomies sont observées dans les pathologies myéloïdes +4, +6, +9, +11, +13, +19, +21,,et +22 (23,24,25) tandis que les trisomies les plus fréquentes dans les LAL sont +4,+6,+10,+14,+17,+18,+20,+21 et +X (26). 32

34 Les anomalies chromosomiques numériques sont particulièrement fréquentes chez les enfants et les adultes présentant une LAL, et leur présence a une signification pronostique (26,27). La LAL near haploïde ou hypoploide est définie par une perte de plusieurs chromosomes (28). L hypodiploïdie la plus courante est de 45 chromosomes (29). La LAL hyperdiploïde est divisée en hyperdiploidie modérée définie par la présence de 47à 50 chromosomes (30), l hyperdiploidie (plus de 50 chromosomes) (31) et la near triploïdie ou la near tétraploïdie est définie par une augmentation importante du nombre de chromosomes de 69 à 96 chromosomes (32) Les anomalies chromosomiques de structure Une variété d anomalies chromosomiques de structure peut être présente dans les cellules tumorales. Des termes avec des définitions précises sont utilisés pour décrire ces changements. Les anomalies chromosomiques de structure observées au cours des hémopathies lymphoïdes et myéloïdes sont les délétions, les iso chromosomes, les chromosomes isodicentriques, les inversions, les anneaux, les translocations, les chromosomes dicentriques, les additions, les insertions, les duplications, les doubles minutes et les marqueurs de chromosomes La délétion (figure 3) Une délétion chromosomique (del.) est la perte d un segment de chromosome. Les délétions peuvent être soit terminales soit interstitielles. Dans la délétion interstitielle, un segment chromosomique interne est perdu et le segment chromosomique proximal et distal au segment perdu, sont juxtaposés. Ainsi la del. (5) (q13 q33) désigne une délétion interstitielle du bras long du chromosome 5 entre les bandes q13 et q33. Dans une délétion terminale l extrémité d un bras du chromosome est absente ainsi la del. (7) q22 désigne une délétion terminale du chromosome 7 avec une cassure au niveau de la bande q 22 et la perte de tout le matériel chromosomique entre la bande 7q22 et le télomère 7q. 33

35 A noter que del (5q) et del (7q) correspondent à la délétion entière du bras long des chromosomes 5 et 7 respectivement. Les délétions chromosomiques les plus communes sont la del(5q),del (7q) et del (20q) dans les LAM et MDS,la del (13q) dans les MDS et les del (6q) et del(9p) dans les LAL (23) Figure 3 : Délétion terminale et interstitielle L isochromosome (fig. 4) Un isochromosome (i) est une anomalie chromosomique de structure qui consiste en deux bras chromosomiques identiques positionnés comme des images en miroir. Les isochromosomes peuvent être monocentriques (un centromère) ou dicentriques (deux centromères).les iso chromosomes les plus courants dans les hémopathies malignes sont i (11q), i (17) et i (21q) dans les LAM, i (7 q), i (9 q) et i (17 q) dans les LAL, i (9q), i (17q) et i (22q) dans les LMC. 34

36 La translocation (fig. 5) Une translocation chromosomique est un déplacement de matériel d un chromosome à un autre chromosome. Les translocations sont habituellement réciproques. Une translocation réciproque est un échange de matériel d un chromosome à un chromosome différent, elle n intéresse habituellement que deux chromosomes et rarement plus que deux, enfin les translocations non réciproques sont également rares Un grand nombre de translocations ont été décrites dans les hémopathies malignes. Dans de nombreux cas les anomalies moléculaires associées ont été identifiées et les mécanismes de la transformation maligne ont été élucidés (33). Quelques translocations s accompagnent de synthèse de nouvelles protéines de fusion. La t (9 ;22) (q34 ;q11) dans la LMC est une translocation réciproque entre les bras longs du chromosome 9 et du chromosome 22, les points de cassure sont au niveau de 9 q 34 et de 22 q11 (figure 5). La signification moléculaire du changement en t (9 ;22 ) (q34 ;q11 ) est le déplacement de l oncogène abl de 9 q 11 35

37 au niveau du locus bcr en 22 q 11 (84,84 ). Un nouveau gène de fusion bcr /abl est créée qui code pour un nouvel RNA de fusion bcr/abl RNA dont l expression est une augmentation de l activité tyrosine kinase qui apparaît suffisante pour induire la transformation maligne (34,35). Au cours des leucémies aigues certaines translocations s accompagnent d une synthèse de facteurs de transcription aberrants. Ainsi dans les APL, la T (15 ; 17) (q22 ; q11-12), le gène du récepteur α de retinoique α (RARα) du chromosome 17 est fusionné au gène PML au niveau 15q 22. Ainsi le gène hybride (PML/RARα) est créé codant pour un facteur de transcription abérrant qui inhibe la différenciation promyélocytaire (36,37) -Certaines translocations entraînent une activation d un oncogène ce sont la t(8 ;14 ) (q24 ;q23 ) dans le lymphome de burkitt, la t (8 ; 14 ) (q24 ;q11 ) dans la LAL de type T et la t (14 ;18 ) (q32 ;q21) dans les lymphomes non hodgkiniens folliculaires. Dans la t (8 ;14 ) (q24 ;32 ),L oncogène c-myc au niveau 8q24 est juxtaposé au gène de la chaîne lourde de l immunoglobuline au niveau de 14q32 entraînant une dysrégulation de la transcription du c-myc (38 ).Dans la t(8 ;14) (q24 ;q11) l oncogène c-myc est activé par la juxtaposition du locus α/δ du récepteur des cellules T (39 ). Dans la t(14 ;18) (q32 ;q21), le gène BCL2 au niveau de 18q21 qui inhibe l apoptose, est surexprimé par la juxtaposition du gène de la chaîne lourde de l immunoglobuline au niveau 14q32 (40 ). Figure 5 : Translocation réciproque. 36

38 Le chromosome isodicentrique Un chromosome isodicentrique (idic) est un iso chromosome avec deux copies du centromère. Les chromosomes isodicentriques sont rares. Un exemple est idic (7p) (77). L idic (7p) consiste en deux copies du bras court et du centromère du chromosome 7, positionnées comme des images en miroir L inversion (fig.6 et 6 bis) Une inversion chromosomique (inv.) est une anomalie chromosomique de structure qui est une rotation de 180 d un segment chromosomique. Les inversions peuvent être péricentriques ou paracentriques. Dans les inversions péricentriques, le segment qui subit une rotation de 180 inclue le centromère. Dans les inversions paracentriques, le segment inverse est soit le bras long soit le bras court du chromosome et n inclue pas le centromère. Ainsi l inv. (16) (p13q22) est une inversion péricentrique, tandis que l inv. (3) (q21 q26) est paracentrique. Ces deux types d inversion peuvent être observées dans les LAM (23). Un autre exemple d inversion paracentrique est l inversion (14) (q11q32) qui est l anomalie chromosomique la plus caractéristique dans la leucémie lymphoïde chronique (LLC) de type T et dans la leucémie pro lymphocytaire de type T (78,79). Figure 6 : inversion péricentrique. 37

39 Figure 6 bis : Inversion paracentrique Le chromosome en anneau (fig. 7) Un chromosome en anneau (r) est un chromosome anormal dans lequel des cassures sont retrouvées dans les bras longs et les bras courts du chromosome et les points de cassure des bras longs et courts se sont rejoints réalisant un cercle fermé ou anneau. Les chromosomes en anneau ne sont pas fréquents dans les hémopathies malignes, ils ont été d abord rapportés dans les LAM et la LMC.Il y a seulement quelques cas de chromosomes en anneau rapportés dans les hémopathies lymphoïdes (23). Figure 7 : Chromosome en anneau. 38

40 Le chromosome dicentrique Un chromosome dicentrique (dic) est un chromosome de structure anormale qui a deux centromères. Les chromosomes dicentriques résultent de la translocation réciproque dans laquelle l un des chromosomes contient les centromères des deux chromosomes impliqués par la translocation. Dans ce cas la méthode FISH peut être utile pour confirmer l identité des centromères et le reste du matériel chromosomique dans le chromosome dicentrique L addition Une addition chromosomique (add) est un gain de matériel chromosomique d origine inconnue par opposition à un gain de matériel chromosomique connu appelé translocation. Un signe plus (+) après le bras du chromosome désigne habituellement le gain de matériel chromosomique qui entraîne un allongement du bras. Par exemple, 14q+ indique la présence d un matériel supplémentaire en 14q. L existence d un chromosome 14 anormal avec un matériel supplémentaire sur son bras long est couramment retrouvé au cours de la LLC (41) Insertion (fig. 8) Insertion (ins) est la présence d un segment chromosomique dans une nouvelle position à l intérieur du même chromosome ou d un autre chromosome. Les insertions sont très inhabituelles. Dans quelques cas, des anomalies de structure qui avaient été décrites d abord comme des insertions ont été réinterprétées comme des translocations Duplication La duplication (dup) est la présence d une copie supplémentaire d un segment chromosomique, de telle sorte qu il existe deux copies du segment dupliqué, juxtaposées au niveau du chromosome. Par exemple, la duplication dup (1) (p12! q13) est une anomalie chromosomique secondaire inhabituelle observée dans les LAL (23). 39

41 Figure 8 : insertion Double-minutes Les chromosomes double-minutes (dmin) sont des marqueurs de chromosomes sans centromères ni bandes. Ce sont de petites structures sphériques qui ressemblent à des diplocoques. Les chromosomes double-minutes sont plus couramment observés dans les tumeurs solides que dans les hémopathies malignes (23) Les anomalies chromosomiques constitutionnelles et acquises Les anomalies chromosomiques numériques et de structure peuvent être soit constitutionnelles, soit acquises Les anomalies chromosomiques constitutionnelles : elles sont présentes dans toutes ou presque toutes les cellules et existent dès le premiers stades de l embryogenèse. Le caryotype constitutionnel de 99 % de la population est normal (42). L anomalie constitutionnelle retrouvée chez les sujets apparemment normaux est une inversion péricentrique du chromosome 9, inv (9) (p 11 q 13), qui est présente chez 1 % de la population. Une anomalie constitutionnelle est désignée par la lettre c, par exemple le caryotype des cellules d une femme atteinte du syndrome de Down est 47, XX, + 21 c. 40

42 Les anomalies chromosomiques acquises Elles peuvent se développer sur des cellules dont le caryotype était normal ou sur des cellules dont les patients avaient déjà une anomalie chromosomique constitutionnelle. Ainsi, le caryotype 47, XX, + 21, désigne une trisomie acquise chez une femme ayant un caryotype constitutionnel normal, par contre le caryotype 47, XX, +21 c désigne la cellule d une femme présentant un syndrome de Down sans anomalie cytogénétique acquise. Enfin le caryotype 47, XX, t (8 ; 21) (q22 ; q22), +21 c est celui d une femme présentant un syndrome de Down avec une anomalie cytogénétique acquise à type de translocation Définition cytogénétique de la clonalité. Lorsque des anomalies cytogénétiques apparaissent dans une cellule, la cellule et sa descendance peuvent avoir un avantage de prolifération ou de survie, créant un clone qui est une population cellulaire provenant d une seule cellule. Sur le plan cytogénétique, un clone est défini par un minimum de deux mitoses cellulaires avec un gain d un même chromosome ou avec la même anomalie de structure ou trois mitoses cellulaires avec une perte d un même chromosome. Les modifications cytogénétiques survenant dans un nombre insuffisant de cellules pour définir un clone, sont considérées comme des changements dus au hasard Les anomalies chromosomiques acquises primaires et secondaires Les anomalies cytogénétiques primaires sont des aberrations qui sont souvent retrouvées comme des changements chromosomiques uniques aux affections malignes. De plus elles sont souvent associées avec des types spécifiques de tumeurs. Les exemples d anomalies cytogénétiques primaires sont la t (8 ; 21) (q22 ; q22) et l inv (16) (p13 ; q22) dans la LAM et la t (15 ; 17) (q22, q11-21) dans l APL, la t (9 ; 22) (q34 ; q11) dans la LMC. Les anomalies cytogénétiques primaires sont liées à la pathogénie de la transformation maligne. 41

43 Les anomalies cytogénétiques secondaires sont des modifications qui surviennent généralement en plus des anomalies primaires. Les chromosomes les plus communément atteints dans les leucémies aigues sont 1, 5, 7, 8, 9, 21, 22, X et Y (23). Les anomalies secondaires telles que +8 peuvent être observées en association avec diverses anomalies primaires. D autres sont associées à des anomalies primaires spécifiques. Par exemple l association de -X et Y avec t (8 ; 21). La trisomie 8 par contre est un exemple d anomalie secondaire qui peut être primaire ou secondaire. Ainsi la présence d anomalies secondaires retrouvées dans un tiers des APL est reconnue comme facteur de mauvais pronostic par certaines études (43), mais pas par d autres (44,45). Par contre la présence d une anomalie secondaire en particulier la monosomie 7 dans la LAL avec chromosome Philadelphie rend son pronostic encore plus sombre (46, 47). 42

44 Tableau I : symboles et abréviations utilisés pour la description des chromosomes et les anomalies chromosomiques (5). Add C Cen Virgule (,) Del Dic Dmin Dup I Idic Ins Inv Mar Moins (-) p parenthèse ( ) point virgule (;) Plus (+) q r t Addition de matériel chromosomique d'origine inconnue anomalie constitutionnelle Centromère Sépare le nombre de chromosomes, les chromosomes sexuels et les anomalies chromosomiques Délétion Chromosome dicentrique Double minute Duplication Isochromosome Chromosome isodicentrique Insertion Inversion Marqueur de chromosome Perte Bras court du chromosome Entoure le chromosome et les points de cassure Sépare les chromosomes et les points de cassure dans les réarrangements intéressant plus d'un chromosome Gain Bras long du chromosome Chromosome en anneau Translocation 43

45 II/ DONNEES ACTUELLES SUR LES ANOMALIES CYTOGENETIQUES DANS LES LEUCEMIES AIGUES : 1/ Caractères des anomalies chromosomiques des leucémies aiguës : Les anomalies chromosomiques des leucémies sont acquises, clonales et non aléatoires. Ces anomalies sont acquises, car retrouvées dans les seules cellules leucémiques, et en règle clonales car identiques d une cellule à l autre. Ces anomalies de nombre et /ou de structure, sont observées plus souvent que ne le voudrait le hasard ce qui leur donne un caractère non aléatoire (ainsi on trouve trop souvent une trisomie 8 dans les LAM) (48,49). Les cytogénéticiens ont récemment franchi un pas de plus en découvrant que de nombreuses anomalies étaient assez spécifiques de certains types de leucémies. Le fait que ces aberrations chromosomiques soient souvent des remaniements de structure avec des points de cassure bien définis a conduit à les appeler remaniements stéréotypés (7). La nature primaire ou secondaire de l anomalie chromosomique fait référence à l événement étiologique de la prolifération. On s éloigne actuellement de cette vision trop simple pour aller vers un processus multi étapes cumulatif. On appelle anomalie primaire une anomalie structurale unique associée à l événement causal et anomalie secondaire : une anomalie généralement de nombre non spécifique d un type donné de leucémie aiguë. Les anomalies non spécifiques et non aléatoires correspondraient à des évènements plus tardifs et ne toucheraient qu une partie des cellules malignes. Ainsi, la trisomie 8, est une anomalie qui survient soit de façon précoce, comme en témoigne sa présence dans toutes les cellules du clone, soit secondairement à d autres remaniements. Les accidents stéréotypés seraient des évènements très précoces dans la leucemogénèse puisque, présents dans toutes les cellules du clone leucémique, 44

46 comme la t (15 ; 17). Enfin il existe de nombreuses anomalies qui s ajoutent les unes aux autres ainsi qu à des remaniements stéréotypés. En cas de rémission complète, on ne retrouve que des mitoses de cellules normales et par conséquent le caryotype médullaire devient normal. A la rechute éventuelle, les anomalies vues à la phase initiale sont en règle retrouvées, souvent compliquées par des anomalies apparues secondairement. 2/ Cytogénétiques des leucémies aiguës lymphoblastiques Une anomalie est détectée dans 70 à 94 % des LAL. Selon les techniques employées et le sous type de LAL. Les cultures de 17h-20h à 48 h sont préférées à l examen direct (50-51). Dans les LAL de type T on rajoute toujours une culture de 72 heures avec deux gouttes d hémaglutinine A (52). Certaines anomalies sont corrélées à un sous type morphologique et immunophénotypique et d autres sont partagées par plusieurs sous types. La valeur pronostique de certaines anomalies chromosomiques est reconnue et prise en compte dans les indications thérapeutiques. Ceci est noté la première fois par Secker Walker et collaborateur (53) et confirmé au 3 ème international Work Shop on chromosomes (TIWCL) et de nombreuses études (12, 15,54) Ploïdie et anomalies de nombre : Tableau. II La ploïdie désigne le nombre de chromosomes, plusieurs groupes de ploïdie peuvent être identifiés dans les leucémies aiguës lymphoblastiques L hyperdiploïdie supérieure à 50 chromosomes [53 à 56] Représente 25 % des leucémies aiguës lymphoblastiques chez l enfant (30,32) et 15% chez l adulte attribuable à une trisomie du chromosome 4, 6, 10, 14, 17, 18, 20, X, Y et 22. Une tétrasomie du chromosome 21 est fréquente (19). Les formes hyperploïdes à plus de 50 chromosomes, qui ont en général un index d ADN > 1,16, ont un pronostic favorable et sont associées au phénotype dit pré. PréB (CD 10+, CD19+, HLA Dr+ (19,55). Il semble que les trisomies associées du chromosome 4 45

47 et du chromosome 10 aient un pronostic particulièrement favorable (96, 6% de survie sans événement à 4 ans) (56). Des caractères clinico-biologiques sont fréquemment associés : enfant de 2 à 10 ans, ou adulte jeune, nombre bas de leucocytes circulants mais dans 50 % des cas, on rencontre des anomalies de structure qui modifient le bon pronostic de ce groupe en particulier chez l adulte (57,58) Hyperploïdie : Ces formes sont de moins bon pronostic (15, 19, 57,58) Hyperploïdie > 65 chromosomes : Ces formes sont rares 1, 5% (15, 19, 57,58) Les formes tétraploïdes (82-94 chromosomes) : souvent associées à un immunophénotype T auraient un pronostic moins favorable (32) L hypoploïdie ( 45 chromosomes) : cette forme est rare de 8 p.100 des cas et de mauvais pronostic (28, 29,58) Anomalies de structure des LAL B LAL et chromosomes Philadelphie t (9 ; 22) :fig. 9 Sa fréquence est de 30% chez l adulte, elle augmente avec l âge (57,59) et atteint près de 50% dans la tranche d âge ans. Elles sont rares chez l enfant moins de 5p 100 des cas en cytogénétique classique (19). La translocation t (9 ; 22) (q34-q11) est identique au plan cytogénétique à celle observée au cours des leucémies myéloïdes chroniques. D autres anomalies chromosomiques variées sont associées dans plus de 50p 100 des cas. La plus fréquente est une perte ou délétion partielle du chromosome 7 qui semble encore aggraver le pronostic (60). 46

48 Tableau II : leucémies aigues lymphoblastiques : fréquence et caractères immunologiques des groupes de ploïdie Ploïdie Nombre chromosomes de Enfant Fréquence % Adulte Immuno pheno type Near haploïdie 23 Hypo diploïdie Hypo diploïdie Pseudo diploïdie 46 Hyper diploïdie Hyper diploïdie > 50 Near triploïdie Near tétraploïdie Normal 46 < 1 < 1 B < 1 1,6 B 6 6 B ou T 41,5 50 B ou T B ou T 27 7 LAL commune < 1 2,9 B 1 3 Plutôt T 8 15 Plutôt T 47

49 Il est important et parfois difficile de différencier une LAL de novo avec t(9 ; 22) d une LMC acutisée en LAL, cependant l existence de métaphases normales et la disparition du chromosome Philadelphie après traitement, sont en faveur d une leucémie aigue lymphoblastique. 1/ Dans la LMC le chromosome Philadelphie est présent dans 100% des mitoses, ce qui n est pas le cas dans les LAL. 2/ 70% des LMC à la phase d acutisation ont d autres anomalies cytogénétiques surajoutées, un isochromosome 17q et / ou une trisomie 8, ce qui est très rare dans le cas des LAL. 3/ Lors de l obtention de la rémission complète à l issue de l induction, l étude du caryotype montre l absence de chromosome Philadelphie dans les LAL, ce qui n est que rarement le cas au cours des LMC. Les anomalies à l échelle moléculaire (taille et type des transcrits de fusion engendrés) sont différentes. trois types de transcrits peuvent être rencontrés, codant pour 3 protéines différentes (p 190,p 210,p 230 ) dont la fonction est vraisemblablement la même. Les caractères des LAL avec t (9,22) sont les suivants :! Forme volontiers hyperleucocytaire! Atteinte méningée initiale fréquente.! Cytologie fréquemment de type FAB L2! Immunophénotype souvent Pré-Pré B exceptionnellement T.! Taux faible d obtention de rémission complète.! Mauvais pronostic dans la plupart des protocoles (8, 5,61). 48

50 Figure 9 : t (9 ; 22), banding R a droite et G a gauche : atlas de cytogénétique (109) Translocation (1 ; 19) (q 23 - P13) et LAL. Pré B. Cette translocation est décrite pour la première fois en 1984 (62,63), elle est présente dans 5 % des LAL et dans 25 % des LAL dites pré B ((présence d une immunoglobuline intra cytoplasmique) (32, 63,65), et seulement 1% des cas des LAL pré-pré B. Cette translocation existe sous deux formes, équilibrée et non équilibrée avec une trisomie partielle du chromosome 1 entraînant la présence des 2 chromosomes 1 en apparence normaux avec un chromosome 19. Cette translocation résulte de la fusion du gène E2A (19p 13) avec le gène PBX1 et la protéine chimérique qui en résulte à une forte activité de transcription (64). Les travaux de Privitéra et al ont suggéré que E2A- PBX1 étaient détectés exclusivement dans les LAL pré B mais non dans les LAL pré-pré B. Mais dans d'autres séries il a été détecté dans les types pré-pré B. Cette anomalie est fréquente chez l enfant (6%) son pronostic est mauvais chez l adulte (91) mais il est amélioré par les protocoles intensifs de chimiothérapie (65-66). 49

51 Translocation (4 ; 11) (q 21-q23) : fig. 10 Ce réarrangement est décrit pour la première fois par Oshimura et al en 1977 et comme une anomalie associée aux LAL par Van Den Berghe et al en 1979 (67). Ces LAL représentent globalement 4% des LAL de l enfant, plus fréquentes chez le nourrisson moins de 6 mois que le nourrisson de 6 à 12 mois et le grand enfant. Sur le plan clinique, elle est caractérisée par un syndrome tumoral important : hépatosplénomégalie et /ou adénopathies, une hyperleucocytose importante avec un taux de blastes circulant élevé. Des anomalies de la bande 11q 23 sont détectables par les techniques de biologie moléculaire dans 70% des LAL de l enfant de moins d un an dont elles expliquent le pronostic péjoratif (68,69). L autre partenaire possible du chromosome 11 dans les LAL est surtout le chromosome 19 (bande 19p13) (70,71). Il s agit parfois de formes biphénotypiques avec présence de blastes monocytoïdes et lymphoïdes (72,73). L immunophénotype est souvent dit Pré-Pré B (HLADR+, CD19+, calla-), on note fréquemment la positivité des marqueurs myéloïdes en particulier CD19 et CDW65 (74). La t (4 ; 11) peut se voir dans les leucémies congénitales. On retrouve dans ce cas un réarrangement du gène MLL avec AF4 (facteurs de transcription). Figure 10 : t (4 ; 11) banding R à droite et G à gauche (109) 50

52 LAL de type Burkitt et anomalies en 8q 24 : fig. 11 Ces LAL rares (moins de 3 % des cas) présentent un immunophénotype B (présence d une immunoglobuline monoclonale de surface) ; exceptionnellement Pré B et sont associées à une anomalie cytogénétique stéréotypée : la translocation t (8 ; 14) (q 24, q 32) observée dans 8 à 9 cas sur 10 (75). On retrouve beaucoup plus rarement deux autres translocations dites variantes impliquant la bande 8q 24 : t (2 ; 8) (p12, q24) et t(8 ; 22) (q 24, q11) (76) cette anomalie est quasiment pathognomonique des LAL de type L3 (74). L analyse moléculaire montre dans les formes endémiques une juxtaposition des gènes Cmyc avec JH et de Cmyc avec Su dans les formes sporadiques. Le pronostic autrefois catastrophique de ces formes a été transformé par les chimiothérapies intensives utilisées dans le traitement des lymphomes de Burkitt (12,77). Figure 11 : t (8 ; 14) ; t (2,8) et t (8,22) dans les LAL de type Burkitt. 51

53 Translocation (5 ; 14) (q31-q 32) : Il s agit d une forme rare de LAL de lignée B (> 1%) associée à une éosinophilie (78, 80, 81,82). Elle entraîne une fusion du gène de l IL3 et de celui codant pour la chaîne lourde d immunoglobuline (19,79) et sa surexpression pourrait être la cause de l éosinophilie (81,82) Délétion du bras court du chromosome 9 : Des anomalies du bras court du ch9 sont observées dans 7 à 12 % des LAL de l enfant (19,74). Il s agit surtout de délétions interstitielles englobant toujours la région 9q 22. Des translocations équilibrées ou non, affectent aussi cette région. D autres anomalies plus rares entraînent une perte complète du bras court en particulier dic (9 ; 12) (p11-12). Le cluster des gènes codant pour l interféron α et l interféron β1 est inclus dans ces segments délétés (83). Il est probable qu un ou des gènes suppresseurs de tumeur soient localisés en 9 p 22, qu il s agisse de gènes de la famille des interférons ou d autres gènes. Les LAL avec dic (9 ; 12) (p11-13) (p11-12) semblent associés à un bon pronostic (84) alors que les autres anomalies semblent plutôt associées à des caractéristiques initiales de mauvais pronostic : hyperleucocytose, splénomégalie importante et phénotype T.Les rechutes méningées semblent particulièrement fréquentes (85) Anomalies du bras court du chromosome 12 : La plus fréquente est la délétion del (12p) p12 isolée par Raimondi en 1983 le plus souvent associée aux LAL de la lignée B, il s agit rarement de type T (86). Cette anomalie est corrélée aux LAL de type L1. Son pronostic semble bon (19). 52

54 La translocation (12 ; 21) q q 22. Elle a été mise en évidence en 1995 dans les LAL de l enfant. Cette translocation a pour particularité de ne pas être détectée par les techniques cytogénétiques conventionnelles mais elle peut être mise en évidence par des techniques moléculaires : hybridation in situ (fish) sur chromosome, southern blotting ou amplification génique in vitro après transcription inverse (RT-PCR) (87). Sur le plan moléculaire la conséquence de cette translocation est la formation d un gène de fusion ou hybride qui correspond à la fusion d une partie du gène TEL en position12p12 avec la quasi totalité du gène AML1 en21q22. Ces deux gènes codent pour des facteurs de transcription, protéine nucléaire qui régulent l expression d autres gènes (88,89). Ils sont connus également pour être impliqués de façon indépendante dans d autres translocations associées à des leucémies principalement myéloïdes. L acide ribonucléique (ARN) de fusion TEL-AML1 qui résulte de la transcription du gène hybride créé par la translocation représente une cible de choix pour la détection par les techniques du RT-PCR (87). Ce gène de fusion est présent dans 16 à 27% des leucémies aiguës lymphoblastiques de la lignée B de l enfant c est l anomalie la plus fréquente connue à ce jour dans les LAL de l enfant. Elle est rencontrée surtout dans la tranche d âge de 1 à 10 ans. Elle n est jamais détectée dans les cellules avec hyperploidie supérieure à 50 chromosomes ni associée aux anomalies cytogénétiques connues comme de mauvais pronostic (90). Il a été suggéré que la présence du gène de fusion TEL-AML1 identifiant un sous groupe d excellent pronostic mais un recul plus important et de larges études prospectives et rétrospectives sont nécessaires pour savoir de façon définitive si la t(12 ; 21) ou son équivalent moléculaire représente un marqueur pour suivre la maladie résiduelle (90).Chez l adulte, à l opposé de l enfant, cette translocation est rare inférieure à 1% Anomalies de structure des LAL T : La fréquence des caryotypes normaux est élevée dans les LAL T, de l ordre de 30 p 100 (19, 91,92). La majorité des caryotypes anormaux sont pseudodiploïdes. 53

55 Certaines anomalies récurrentes mais rares ont été spécifiquement associées aux LAL T. 40% des anomalies impliquent le chromosome 14 (bande q 11) ou le chromosome 7 (bandes 7q34-36,7p15). Ces remaniements concernent au niveau moléculaire les gènesα, β et δ du récepteur T à l antigène respectivement localisé en 14q11 (TCR a et d),7q 34-36(TCRb) et 7p 15(TCRg) (19,92) Translocation (8 ; 14) (q 24-q11) : Elle est exceptionnelle observée à la rechute et non à la phase initiale (elle est probablement secondaire). La nature monoclonale de leucémie aiguë initiale a été affirmée par la mise en évidence du réarrangement TCRβ. Sur le plan clinique rien ne peut la différencier des autres LAL. Sur le plan cytologique, il s agit de type L1 ou L2 (93) T (1 ;-4) P13 q 11 : Cette translocation est également décrite dans les LAL T et passe dans le gène TCRα. D autres translocations en 14q11 et intéressant probablement le locus TCR α dans les LAL T (7). La t (10 ; 14) (q 26 q 11) est associée à un taux de survie important chez l'adulte et semble l'être chez l'enfant mais seulement en analyse univariée. D'autres anomalies sont décrites dans les LALT : translocation (1 ; 14) (p32 q11), délétion 9 (p 21) décrite par Kaniko et al dans les LAL qui se révèlent être des LAL T (7). 3/ Anomalies chromosomiques des LAM : Des anomalies chromosomiques clonales acquises sont retrouvées chez 50 à 70% des patients présentant une leucémie aiguë myéloïde de novo (74, 94,95). Ce taux peut arriver à 90% selon certaines études (13,96). Certaines de ces anomalies sont biens corrélées à un type FAB donné et ont aussi une valeur diagnostique. D autres ont une valeur pronostique, même si, globalement, le poids pronostique des anomalies cytogénétiques observées au cours des LAM apparaît plus faible que dans les LAL de l enfant. 54

56 Le caryotype est le plus souvent pseudodiploïde. Les hypo ou hyperploïdies franches sont rares au cours des LAM. Dans la majorité des cas il s agit de translocations réciproques équilibrées mais il peut s agir aussi de translocations variantes comportant un seul chromosome de la translocation spécifique et un autre chromosome ou de translocation complexe à trois chromosomes ou plus (97 ). La peinture chromosomique permet dans certains cas de déceler des translocations variantes non visibles en cytogénétique Anomalies spécifiques de sous types de leucémie aiguë myéloïde : Translocation t (8 ; 21) (q22 q22) : (fig. 12 et 13) Cette anomalie a été décrite pour la première fois en 1973 par Rowley dans les leucémies aiguës non lymphoblastiques (98). Elle est retrouvée dans 5% des LANL collectées au niveau du premier travail international sur les chromosomes dans les leucémies aiguës (73). Elle a fait l objet de nombreuses publications qui ont permis de dégager les caractéristiques cliniques et cytologiques de cette entité. Kawada et al en R.Berger et al en 1981 (99, 100). Elle représente 12% des LAM à caryotype anormal et constitue un contingent important des LAM2 de la classification FAB (40%) (104), très exceptionnellement il s agit de LAM1, LAM4 ou LAM5. Elle est caractérisée par sa survenue chez l adulte jeune et l enfant, la fréquence de la splénomégalie et des chloromes (100) ; sur le plan cytologique, il s agit de grands myéloblastes avec un cytoplasme abondant contenant de grands bâtonnets d Auer à la fois pointus, minces et assez nombreux. Une hyperéosinophilie est fréquente ainsi qu un Pseudo Pelger Huet (100, 101, 102,103). (Voir fig. 13). Les anomalies secondaires sont fréquemment associées : la perte d un chromosome sexuel Y chez l homme et X chez la femme, la délétion interstitielle du bras long du 9 (9q21, q31) la délétion 7q ou monosomie 7 et la trisomie 8. Quelques cas de translocations complexes ont été décrits similaires aux translocations complexes de la leucémie myéloïde chronique (104).sur le plan immunologique les blastes expriment souvent a la fois des marqueurs lymphoïdes B CD 19 aveccd33, CD34 et moins souvent le CD56 55

57 Deux gènes sont impliqués dans la t (8 ; 21) qui est équilibrée du point de vue cytogénétique, il s agit sur le chromosome 21 en position q22 du gène AML1 et sur le chromosome 8 en position q22 du gène ETO (Eight twenty one) ou MTG 8 (Myéloïde Translocation Géne on 8). Le gène AML 1 fut découvert par Miyoshi en Il montre de grandes similitudes avec le gène de segmentation (domaine «zunt» de la drosophile avec la sous unité alpha de la protéine PEBP 2 (Polyoma Enhancer Binding Protein). AML1 code pour la sous unité alpha du facteur de transcription CBF qui joue un rôle important dans la différenciation hématopoïétique (105). Il est intéressant de noter que la sous unité β de CBF est impliqué dans l inv (16 / t (16-16), anomalie observée dans les LAM4 à éosinophile et qui sont avec la t (8 ; 21) q 22, q22 les anomalies les plus fréquentes des LAM. Le gène ETO d après G. nucifora et al 1993 n a pas d homologie avec des protéines connues mais il est caractérisé par deux domaines doigts de Zinc (Zinc Fingers) et plusieurs domaines riches en serine et en proline. D après R.Berger 1994 le gène ETO aurait une homologie avec la cycline D2. Le gène chimérique découlant de cette translocation comprend un Intron de 25 kb du gène AML-1 (région 5 contenant le domaine zunt ) et la quasi totalité du gène ETO, il est situé sur le chromosome 8 et entraîne la formation d un transcrit de fusion codant pour un facteur de transcription chimérique. La connaissance de la séquence de nucléotides de ce gène chimérique a permis de développer des outils moléculaires pour le détecter et par conséquent la translocation (8 ; 21). Il s agit du FISH, Southerns Blot /RT-RCR et de la PCR. Le pronostic de cette forme avait été jugé plutôt favorable, avec un pourcentage très élevé de rémission (14, 119, 106,107) et une bonne durée de rémission complète, sauf quand il associe une perte d un chromosome sexuel. Une étude du GFCH (Groupe français de cytogénétique hématologique) (129) portant sur 100 cas, a confirmé que le taux de rémission est élevé mais la durée de la 56

58 rémission complète est variable. Actuellement on la considère de bon pronostic (108,109). Figure 12: t (8 ; 21) banding R à droite et banding G à gauche : Atlas de Cytogénétique : Roland Berger (109). Figure 13 : hyperéosinophilie et Pseudo Pelger Huet dans les LAM2 avec t (8 ; 21). George Flandrin (105). 57

59 Translocation (15 ; 17) q 22, q12, q 2 1 et LAM 3. (Fig. 14 et 15) Rapportée en 1978 par Testa et al., exclusivement liée au phénotype promyélocytaire. La translocation t (15 ; 17) q25-q22) a été progressivement reconnue très spécifique puisque l on considère actuellement que la très grande majorité des LAP M3 [ 14,73,110 ] ont le remaniement apparemment équilibré. Cette translocation est décelée après culture de moelle à court terme 24 h heures à 48 heures. Alors que l on pouvait ne trouver que des mitoses normales après examen direct. En corrélant les résultats cytogénétiques et ceux obtenus après examen cytologique des mêmes cultures, on a pu montrer que les mitoses normales étaient celles des érythroblastes abondants à court terme, plus rares après 24h. Inversement les mitoses des promyélocytes étaient observées préférentiellement après 24h ou 48h de culture, où les mitoses avaient la translocation (111). Ainsi une population régulière d érythroblastes normaux cohabitait avec la prolifération promyélocytaires, leucémique, anormale. On observe un pourcentage élevé de décès lors du traitement d induction, mais lorsque la rémission est obtenue, de longues survies peuvent être obtenues. (14,112). La forme M3 variante dont les blastes ont une granulation fine dite micro granulaire parfois invisible au microscope optique, est aussi caractérisée par la t(15 ; 17). Mises en culture les cellules blastiques acquièrent progressivement une morphologie de promyélocytes avec une augmentation de la taille des grains. Cette forme variante est hyperleucocytaire en périphérie, au contraire des M3 banales (fig 15.) et son évolution est souvent grave (113). Les translocations variantes, impliquant la bande q12-q21, comme la t (11 ; 17) sont relativement rares. Des anomalies additionnelles, comme la trisomie 8 parfois une délétion en 7q ou del 9q, sont en revanche assez fréquentes. Le gène de fusion PML RAR α caractéristique de la LAM3 est retrouvé dans près de 100% des cas. Trois grands types de points de cassures sont décrits sans caractère pronostique reconnu pour chacun. Des 58

60 transcrits PML-RAR α avec caryotype normal, ont été rapportés. Il est clair que les patients porteurs de ces transcrits peuvent répondre favorablement à l agent de différenciation qui est l acide Tout Trans rétinoïque surtout lorsqu il est utilisé en association avec la chimiothérapie. Cette anomalie est considérée actuellement de bon pronostic (114, 115, 116,117). Figure 14 : t (15 ; 17) : banding R à droite et banding G à gauche : atlas de cytogénétique (109). Figure15 : LAM3 avec t (15 ; 17) : George Flandrin (105). 59

61 Inversion du ch. 16 p13 q 22 et LAM4 E0 : (fig16 et 17) L inversion du chromosome 16 a été rapportée initialement par Arthur et Bloomfield en 1983 qui ont décrit une délétion du bras long du chromosome 16 associées à une hyperéosinophilie (118) fig. 17. Le Beau et al confirment l inversion du chromosome 16 (119). Cette anomalie est spécifiquement associée aux LAM4 avec maturation éosinophile anormale. Des délétions del (16 q22) ont été également rapportées. Des anomalies additionnelles associées sont fréquentes : trisomie 8, trisomie 21, trisomie 22 et monosomie 7 partielle (7q-) (79). Le pronostic est meilleur que celui des autres LAM mais on signale une fréquence plus importante des rechutes méningées. Le gène de fusion impliqué dans cette translocation CBF β -MYH 11 détecté par PCR, pouvant être présent également dans les LAM5. L identification moléculaire de ce marqueur est particulièrement intéressante car l inversion 16 peut être difficile à mettre en évidence par les méthodes cytogénétiques classiques. Cette anomalie est considérée de bon pronostic (120,121) Figure 16 : del. 16 en cytogénétique conventionnelle à gauche et inv16 en Fish Atlas de cytogénétique (109). 60

62 Figure17 : LAM4 avec hypereosinophilie associée à une inv16 : George Flandrin (105) Anomalie de la bande 11q 23 : Les remaniements de la bande (11q 23) constituent une anomalie de structure fréquente dans les leucémies aiguës en général (2 à 10%) tout âge confondu avec une incidence particulièrement élevée chez le jeune enfant. Une trentaine de translocations impliquant la bande 11q 23 et un autre partenaire ont été rapportées. Ces translocations sont spécialement fréquentes chez les nourrissons atteints de LAM (ou de LAL) chez qui elles sont présentes dans 70% des cas diagnostiqués avant 6 mois (122,123). La première anomalie décrite impliquant cette bande c'est la translocation t (4 ; 11) (q21 - q23) associée aux leucémies aiguës lymphoblastiques. Des études ultérieures ont montré que la bande (11q 23) pouvait être associée à d autres chromosomes partenaires que le chromosome 4 dont la liste s'allonge régulièrement. Ce réarrangement est décrit dans 5 à 6% des leucémies aiguës myéloïdes de novo (124). Les translocations les plus fréquemment rencontrées sont la translocation (9 ; 11) (p21 - q23) dans les LAM à différenciation monoblastique (LAM 5 de la classification FAB) (fig.18) et les translocations 61

63 t(11 ;19) (q23 - p13) et (6 ; 11) (q27-23) ( ). Enfin elles sont également décrites lors des LAM secondaires à l utilisation des épipodophyllotoxines : agent inhibiteur de l'adn topoisomérase II dans 75% des cas (19). Ce remaniement est habituellement associé à une hyperleucocytose. Des marqueurs lymphoïdes B peuvent être associés aux marqueurs myéloïdes ou monocytaires. Dans tous les cas c est un facteur de mauvais pronostic (126). Les techniques de biologie moléculaire ont permis d'identifier le gène au niveau de la bande (11q 23) : gène ALL1 (Acute lymphoblastic Leukemia) aussi dénommé MLL (Mixed Lineage Leukemia). Figure 18 : LAM5 associée à une t (9 ; 11) : George Flandrin (105) 3.2. Autres anomalies récurrentes au cours des LAM : t (8 ; 16) (p 11 ; p13) et LAM5 b : Décrite en 1987 par Bernstein et al. Elle est associée à la LAM5b et caractérisée par la présence d une érythrophagocytose médullaire (127) t(1 ; 22) p11 p13 et LAM7 : Il s agit de la seule translocation spécifiquement associée aux leucémies mégacaryoblastiques. Elle est retrouvée dans environ un quart des LAM7 d enfants non trisomiques (128,129). Cette anomalie n a pas été rapportée chez les trisomiques malgré la fréquence des LAM7 sur ce terrain. 62

64 La t (6 ; 9) (p 23 q 34) : associée à une basophilie est observée dans les LAM1, LAM2, LAM4 avec myélodysplasie précédente ou concomitante (20%) (130). Cette translocation entraîne la fusion des gènes CAN et DEK (131). Le gène CAN est localisé en (9q 34) et code pour une nucléoporine capable d'interagir avec 2 protéines hcrm1 et nu p88 retrouvées elles aussi sur la membrane nucléaire et participant à la formation d'une nucléoporine complexe. Le gène DEK est situé en (6p 23) et code pour une protéine dotée d'un domaine ADN banding séquence spécifique impliquée dans la régulation transcriptionnelle nucléotidique.( Fig. 19 et 20). Figure19 : t (6 ; 9) : banding R à droite et G à gauche (109). Figure. 20 : LAM avec basophilie associée à une t (6 ; 9) (105) 63

65 La trisomie 8 : C'est l'anomalie de nombre la plus fréquente dans les L.A.N.L. Elle survient dans 25% des cas, elle est spécifique au désordre myéloïde et très rare dans les leucémies lymphoïdes. Les L.A.N.L avec trisomie 8 sont souvent précédées d'un syndrome myélodysplasique et ne sont pas spécifiques d'un type FAB donné mais il apparaît comme une anomalie primaire plus fréquente dans les LAM1 et les LAM4 et M5. Comme anomalie chromosomique secondaire, la trisomie 8 est fréquente dans LAM 3 et enfin dans LAM1 et LAM2. Elle constitue un facteur de mauvais pronostic (94,132) La translocation t (9 ; 22) (q 34 q11) : Elle est observée surtout dans les LAM1 et parfois LAM2. Sa fréquence est faible 2 à 3% des LAM et pose le problème du diagnostic différentiel avec la leucémie myéloïde chronique acutisée d emblée en leucémie aiguë myéloïde. Elle est de mauvais pronostic (82, 133,134) Les réarrangements du Ch.3 inversion (3) (q 21 q26) ou t (3 ; 3) (q21 q 26) sont observés dans différents types de LAM : M1, M2, M4 et M7. Cette anomalie structurale du chromosome 3 impliquant la région 3q est associée à une thrombocytose avec une dysmégacaryopoïèse : le nombre de mégacaryocytes dans la moelle osseuse est élevé avec de nombreux micromégacaryocytes à noyaux hypolobulés. Ceci a suggéré que les gènes impliqués dans la maturation mégacaryocytaire sont situés au niveau de la région 3q. Cette anomalie est décrite la première fois en 1982 par Bernstein et Al., chez des patients atteints de LAM avec un taux de plaquettes élevé, par la suite elle a été rapportée par de nombreuses équipes confirmant son association à une anomalie de production des plaquettes (7,97) La monosomie 7 ou délétion 7q (fig. 21) : c'est la deuxième anomalie de nombre fréquente dans les LANL. Elle est retrouvée dans 4% des cas. Elle peut être rencontrée dans les syndromes myélodysplasiques, les syndromes myéloprolifératifs et les leucémies aiguës secondaires. La perte de tout le chromosome peut-être précédée d'une monosomie partielle. Longtemps considérée 64

66 comme facteur de mauvais pronostic, mais la surveillance à long terme des patients du 4 ème INCL a permis de lui attribuer une valeur plus favorable (14-126). Figure. 21 : del. 7q (109) La monosomie 5 ou délétion au 5 q (fig. 22) : le point de cassure est variable (q 13 à q34). Sa fréquence est de 10 à 15 % chez l adulte mais elle n est isolée que dans 3% des cas. Sa fréquence est plus élevée chez les adultes âgés faisant suspecter une myelodysplasie sous-jacente. Elle serait, avec l anomalie du 7, fréquente dans les LAM6. Le pronostic est mauvais avec un taux faible de rémission complète et une survie médiocre (94). Figure22: délétion 5 q banding R à droite et G à gauche Perte du chromosome Y : La perte du chromosome Y dans les cellules médullaires est un phénomène relativement fréquent chez le sujet âgé et considéré comme normal lié à l'âge, mais la perte de ce chromosome peut représenter une aberration chromosomique associée à une LAM survenant très souvent secondairement en association à une anomalie primaire, telle que la translocation t (8 ; 21) dans les LAM 2 (104). 65

67 3.3. Autres anomalies très rares : < 1% t (x, 10) décrit chez 2 patients en 1996 porteurs d une LAM4 dans un cas et d une leucémie aiguë biphénotypique dans un autre cas. t (3-11) (q 21-q 13) : 2 cas rapportés en 1995 respectivement des LAM1 et LAM 5b + 21, 9q, +11, Iso 17 q, 20q, Applications pratiques La reconnaissance des anomalies cytogénétiques dans les leucémies aigues myéloïdes est à la base de la nouvelle classification internationale (OMS 2000) (135), et a permis d établir une classification pronostique indépendante des autres caractères de la maladie La nouvelle classification OMS (tableau III) distingue un premier groupe de LAM en fonction de l existence de certaines anomalies cytogénétiques récurrentes (136)! LAM avec t (8 ; 21) (q22 ; q22)! LAM avec t (15 ; 17) (q22 ; q11-12)! LAM avec inv. (16) (p13 ; q22) ou t (16 ; 16) (p13 ; q22)! LAM avec anomalies 11 q 23 Ces anomalies cytogénétiques sont retrouvées chez 30% des patients atteints de LAM. Dans les cas de LAM avec t (15 ; 17), t (8 ; 21) et inv. (16) ou t (16 ; 16), il existe une corrélation étroite entre les anomalies génétiques et les caractères morphologiques des cellules blastiques et de ce fait l anomalie génétique peut être habituellement prédite sur l aspect morphologique après étude microscopique du sang et des frottis médullaires. De plus, en raison du fait que les LAM associées à ces anomalies possèdent des caractères cliniques distinctifs et une réponse favorable à un traitement approprié, elles peuvent être considérées comme de vraies entités clinico-pathologiques. Quant aux anomalies du 11q23, bien qu elles soient souvent associées à des LAM à différenciation myélomonocytaires ou monocytaires, l aspect morphologique à lui seul ne permet pas de préjuger de l anomalie cytogénétique. 66

68 Tableau III : Classification des leucémies aigues myéloïdes (OMS 1999). LAM avec translocations chromosomiques récurrentes : LAM avec t (8 ; 21) (q22 ; q22), AML1 (CBF-alpha)/ETO LAM avec t (15 ; 17) (q22 ; q11-12), PML/RAR-alpha et variantes LAM avec inv. (16) (p13 ; q22) ou t (16 ; 16) (p13 ; q22), CBF-béta/MYH11 LAM avec anomalies 11q23 (MLL). LAM avec myélodysplasie «multilignée» Avec antécédent de SMD Sans antécédent de MSD LAM et SMD «secondaire» à des thérapeutiques Après agents alkylants Après épipodophyllotoxin «secondaires» d autres types LAM n entrant pas dans les catégories précédentes LAM avec différenciation minimale (MO) LAM sans maturation (M1) LAM avec maturation (M2) LAM «promyélocytaires» (M3) LAM avec différenciation myélomonocytaire (M4) LAM monocytaire (M5) LAM avec différenciation érythroblastique (M6) LAM avec différenciation mégacaryocytaire (M7) LAM avec différenciation basophile LAM avec myélofibrose LAM binéphotypique 67

69 Classification pronostique L analyse cytogénétique effectuée au moment du diagnostic est actuellement reconnue comme le facteur pronostic le plus favorable dans les LAM (137,138). Une étude récente du SWOG (southwest oncology group) portant sur 804 patients âgés de 16 à 55 ans dont 609 (80%) ayant un caryotype interprétable, classe les patients en quatre groupes pronostiques (Tableau IV) (139) Groupes pronostiques Favorable Anomalies cytogénétiques Nb patients N : 609 inv. (16) t (16 ; 16)/ del (16q) t (15 ; 17) sans autres anomalies t(8 ;21) sans del(9q) ou 121 (20%) caryotypes complexes Intermédiaire Défavorable Caryotype normal + 8, +6,-Y, del (12p) del (5q)/-5, -7,/del (7q) anomalies 3q, 9q, 11q, 20q, 21 et 17p t (6 ; 9), t (9 ; 22) et caryotypes complexes ( 3 anomalies) 278 (46%) (dont 244 caryotypes normaux) 184 (30%) Indéterminé Toutes les autres anomalies 26 (4%) Tableau IV : Classification pronostique des leucémies aigues myéloïdes en fonction des anomalies cytogénétiques (SWOG) (139). Dans cette étude pour 20% des patients (n=154), l étude du caryotype n a pas été possible : absence de prélèvement (n=30), absence de pousse à la culture (n=62), nombre de cellules analysables insuffisants (n=62). Après traitement d induction identique associant Idarubicine 12 mg/m2/j (3 jours) et Arac 100mg/m2/jour en perfusion continue (7 jours). Sur les 609 patients, seuls 584 sont évalués. Une rémission complète a été obtenue chez 412 patients (71%). Le taux de RC varie de manière significative (p < ) parmi les 3 groupes pronostiques reconnus, de 84% (98 de 117) pour le groupe favorable, à 75% (205 68

70 de 270) pour le groupe intermédiaire, à 55% (96 de 173) pour le groupe défavorable. En ce qui concerne le taux de survie globale, sur les 609 patients ayant une analyse cytogénétique évaluable, 403 décès ont été observés (66%). Parmi les 206 patients restants, la médiane de survie est de 58 mois (8 à 94 mois), la différence de survie estimée à 5 ans est hautement significative en fonction du groupe pronostique, elle est de 55% dans le groupe favorable, 38% dans le groupe intermédiaire et 11% dans le groupe défavorable. Ces résultats rejoignent ceux obtenus par le groupe MRC (Medical Research Council) (140). III/ RAPPEL DES CLASSIFICATIONS MORPHOLOGIQUES ET IMMUNOLOGIQUES DES LEUCEMIES AIGUES : La première classification internationale actuellement toujours reconnue et universellement utilisée est la classification FAB mise au point par un groupe d hématologistes Français Américains et britanniques (FAB) en 1976 (141). Cette dernière est basée sur la morphologie des blastes observés sur les frottis de sang et de moelle osseuse colorée au May Grunwald Giemsa (MGG) complétée par l étude des colorations cytochimiques (myélopéroxydase ou noir Soudan et estérases (142, 143, 144, 145). Dans les deux années qui ont suivi la classification FAB, la première classification immunologique phénotypique concernant les leucémies aiguës a été publiée en 1978 (146), permettant d individualiser trois types de LAL : LAL de type B caractérisée par une immunoglobuline (Ig) à la surface des blastes, la LAL de type T dont les blastes présentent un récepteur pour les globules rouges de mouton ou rosette (E) et LAL non T non B qui ont permis la réparation d un anticorps reconnaissant un antigène propre à ces cellules (common Acute Lymhoblastic Leukémia Antigen ou antigène calla), par la suite la découverte d un grand nombre de molécules par la technique des anticorps monoclonaux a permis d affiner la classification des LAL. L immunophénotypage des LAM est survenu 69

71 plus tard en 1987 ( ). Actuellement la classification immunologique des leucémies aiguës est devenue indispensable. 1/ La classification morphologique FAB : 1.1. Les bases de la classification morphologique : l étude cytologique se fait sur des prélèvement initiaux avant tout traitement cytotoxique, au mieux sur des frottis sanguins, sinon médullaires en cas de forme aleucémique, colorés au May-Grünwald-Giemsa (MGG) ou par la coloration de Wright, suffisamment riches afin d avoir un échantillon représentatif de la prolifération. L analyse morphologique des cellules repose sur les éléments suivants : la taille et la forme des cellules, le rapport nucléo-cytoplasmique (N/P), les caractères du noyau (forme, aspect de la chromatine, présence ou absence de nucléoles), aspect du cytoplasme (degré de basophilie, présence ou absence de granulations azurophiles), recherche dans les cytoplasme de bâtonnets d Aüer qui se présentent sous forme d une inclusion allongée de coloration rouge correspondant à des granulations azurophiles alignées et cristallisées, leur présence bien qu inconstante est caractéristique des leucémies aiguës myéloïdes. L étude cytologique est complétée par des techniques cytochimiques qui sont indispensables pour documenter l origine myéloïde de la prolifération. Il s'agit de la réaction des myéloperoxydases ou du noir Soudan et de la réaction des estérases spécifiques monocytaires Les Leucémies aiguës myéloïdes (Tableau V) Le diagnostic de leucémie aiguë myéloïde est porté lorsque le pourcentage de blastes est supérieur à 30% des cellules nucléés dans une moelle riche. Cette limite sépare les leucémies aiguës myéloïdes des syndromes myélodysplasiques (MDS) en l absence de transformation. 70

72 Lorsque le pourcentage d érythroblastes est élevé (>50%) et risque de gêner l appréciation du pourcentage de blastes, on effectue un nouveau décompte en excluant les érythroblastes. La classification FAB 1976 (149) a défini 6 catégories de leucémies aiguës myéloïdes de M1 à M6 selon leur différenciation cytologique vers une lignée ou plusieurs lignées et le degré de maturation des cellules. Ainsi M1, M2 et M3 présentent une différenciation granuleuse prédominante et différent les unes des autres par le degré et la nature de la maturation granuleuse ; M4 présente une différenciation à la fois granuleuse et monocytaire ; M5 une différenciation monocytaire prédominante et M6 une différenciation érythroblastique prédominante. La classification FAB des leucémies aiguës myéloïdes a été revue en 1985 (150) (Tableau V). Plus récemment, deux autres types de leucémies aiguës myéloïdes ont été décrits et ajoutés à la classification : leucémie aiguë mégacaryoblastique (M7) (151) et leucémie aiguë myéloïde très peu différenciée (M0) (26). Leur caractérisation fait appel à des techniques complémentaires telles que l immunophénotypage et éventuellement l étude ultrastructurale avec cytochimie. 71

73 72

74 La leucémie mégacaryoblastique M7 : Cette forme de LA n avait pas été envisagée dans la description initiale du FAB. Elle est très rare. Elle s accompagne fréquemment d une myélofibrose responsable de frottis de moelle pauvres et difficilement interprétables. La morphologie des blastes peut-être très variée : certaines cellules peuvent ressembler à des lymphoblastes, avec un cytoplasme peu abondant et une chromatine assez dense, alors que d autres évoquent des blastes de leucémie aiguë myéloblastiques très peu différenciée. Des projections cytoplasmiques pseudo-auriculaires ou des plaquettes accolées aux blastes, associées parfois à des mégacaryocytes dystrophiques de la prolifération. La confirmation du diagnostic repose sur :! La détection des glycoprotéines IIb/IIIA ou de la glycoprotéine Ib à la surface des blastes.! La démonstration d une activité péroxydasique plaquettaire par l étude ultrastructurale avec cytochimie. La leucémie aiguë myéloïde très indifférenciée ou M0 : Elle représente 1 à 2% des leucémies aiguës myéloïdes. Les blastes ne montrent aucun critère cytologique de différenciation (absence de granulations, absence de corps d Auer) et ne peuvent être distingués des blastes des leucémies aiguës lymphoblastiques. Les examens cytochimiques sont négatifs. Le diagnostic sera porté par l étude immunologique qui montre l expression d au moins un des antigènes associés à la lignée myéloïde (CD13 ou CD33) et la négativité des marqueurs lymphoïdes. Dans certains cas, on peut mettre en évidence quelques granulations myélopéroxydase positives par une étude cytochimique ultrastructurale. Actuellement remplacée par l utilisation d un anticorps monoclonal anti-myélopéroxydase dont la positivité intra 73

75 cytoplasmique est détectée par cytométrie en flux. En effet, la taille des grains est en deçà des limites de résolution du microscope optique et le nombre est souvent faible. On peut évoquer également certaines leucémies aiguës «érythroblastique» très indifférenciées dont les blastes ne peuvent être rattachés à la lignée érythroblastique que par des techniques immunologiques et ultrastructurales Les Leucémies Aigues Lymphoblastiques (LAL) La classification FAB divise les leucémies aiguës lymphoblastiques en 3 groupes : L1, L2 et L3 ou type Burkitt ; les caractères pris en considération pour les définir sont : la taille de la cellule, la forme du noyau, la présence de nucléoles, l aspect de la chromatine, la qualité et la basophilie du cytoplasme (152). (Tableau VI) Le diagnostic de L1 est facile à porter sur l aspect morphologique des blastes et la coloration des myélopéroxydases qui est inférieur à 3% des cellules blastiques, le diagnostic de L3 est également non ambigu sur le seul aspect morphologique des blastes, par contre le diagnostic de L2 est difficile sur le seul aspect morphologique des blastes, il se pose en particulier avec celui de M0 car aucun critère morphologique et cytochimique ne les séparent d où l importance des méthodes immunologiques. 74

76 Tableau VI : Caractères cytologiques des LAL Caractères cytologiques Taille de la cellule Aspect de la chromatine Forme du noyau Nucléole Quantité de cytoplasme Basophilie du cytoplasme Vacuoles cytoplasmiques L1 L2 L3 Petites cellules Grandes cellules, taille hétérogène Homogène Variable, hétérogène Régulière, parfois encoché et indentée Non visible ou petit Réduit Faible ou modérée Variable Irrégulière, souvent encoché et indentée Un ou plusieurs, souvent grand Variable, souvent modérément abondant Variable, parfois intense Variable Grandes cellules, taille homogène Finement grenue et homogène Régulière : ronde ou ovalaire Proéminent, un ou plusieurs Modérément abondant Très intense Nombreuses le plus souvent 2/ Classification Immunologique : Le diagnostic immunologique des leucémies aiguës a été révolutionné par l introduction des anticorps monoclonaux qui a pratiquement supplanté les techniques classiques (immunofluorescence de membrane, recherche de rosettes 75

77 avec les globules rouges de mouton, mise en évidence de l enzyme nucléaire TDT (Terminal Desoxy Nucléotydil Transférase). Les laboratoires d Hématologie utilisent des batteries d anticorps monoclonaux qui reconnaissent les antigènes exprimés à la surface ou dans le cytoplasme des cellules leucémique. Les anticorps utilisés varient d un laboratoire à l autre ; afin d unifier la terminologie, plusieurs ateliers internationaux se sont réunis pour confirmer les résultats des différents laboratoires ( ), ils ont permis de regrouper les anticorps réagissant avec les mêmes populations cellulaires et reconnaissent une même structure de poids moléculaire déterminé dans une seule classe de différenciation Le développement des techniques permettant la détection des antigènes des cellules a facilité la différenciation lymphoïde et myéloïde et a permis la reconnaissance de sous classe de leucémies aiguës par la détermination des phénotypes immunologiques des cellules leucémiques au moment du diagnostic. Il est possible d identifier la lignée cellulaire et le stade de maturation dont elles dérivent. aiguës : 2.1/ Les bases de la classification immunologique des leucémies Les principaux marqueurs utilisés (159) Ils Permettent la distinction entre les LAL et LANL et l identification des sous classes de LAL et LANL et l identification des sous classes de LAL type B et T, il comprend :! Les marqueurs lymphoïdes de la lignée B : CD 19 Cyt CD22, CD79a, CD10! Les marqueurs lymphoïdes de la lignée T : CD2 CD7 cyt CD3! Les marqueurs de la lignée myéloïde : CD13 CD33 CD117 et anti MPO (antimyélopéroxydase) 76

78 ! Les marqueurs des cellules souches hématopoïétiques : CD34, TdT et HLA DR. Certains marqueurs ont une spécificité pour une lignée donnée comme :! Le CD3 pour les lymphoblastes T (Janossy 1959)! CD 79a pour les lymphoblastes B (Bucchéri ; 1993)! Anti MPO pour les cellules myéloïdes (Bucetien 1992)! CD 41 ; CD 42 pour les cellules mégacaryocytaires Techniques utilisées : Plusieurs techniques de révélation de la réaction antigène anticorps utilisant les différents CD anticorps monoclonaux (AcM) ont été développées La technique immuno-enzymatique sur lame Cette technique permet la lecture des cellules sur lames, mais elle est beaucoup moins utilisée depuis l avènement de la cytométrie en flux Technique de cytométrie en flux : (160) Cette technique permet l analyse des cellules ayant fixé préalablement des molécules fluorescentes couplées en (AcM) en suspension dans une veine liquide réalisant un flux laminaire au travers d un faisceau laser. Les informations relatives à chaque cellule sont représentées par l unité informatique sous forme d un histogramme ou d un cytogramme et permettent de donner une indication à la fois du nombre de cellules positives et de l intensité de la positivité pour chacune d elles. 77

79 2.2. Profil phénotypique des leucémies aiguës : Les leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) : Les LAL sont classées en deux groupes : les LAL de type B et les LAL de type T par l utilisation des anticorps monoclonaux décrit précédemment Sous classification des LAL B : Figure 23 Quatre types de leucémies aiguës lymphoblastiques B peuvent être individualisés en utilisant les marqueurs suivants : (TdT + CD19 + CD79a + Cyt CD22) LAL «ProB» ou BI ou LAL nulle ou Early B cell precursor ou l antigène CALLA (common acute lymphoblastic leukemie antigen) n est pas exprimé. LAL Pré- Pré B ou BII ou LAL communes qui expriment le CD 10. LAL «Pré B ou BIII : qui exprime la chaîne µ intra cytoplasmique. LAL B mature B IV : qui exprime l immunoglobuline de surface. 78

80 B I B II B III B IV HLA - DR CD 19 CD 22 Cytoplasmique CD 79a Cytoplasmique CD 10 ± * CD 20 Cyt µ sig Adultes (15-60 ans) 15 % 66 % 15 % 4 % Enfants (1-15 ans) 6 % 78 % 14 % 2 % * Le marqueur CD 10 est négatif à ce stade dans la différenciation normale alors qu il est retrouvé dans les LAL de type «Burkitt». Figure 23 : Classification immunologique des leucémies aigues lymphoblastiques B 79

81 TI TII TIII TIV CD 7 CD 5 CD 2 CD 3 Cytoplasmique TCR CD 1 CD 4 ± CD 8 ± Figure 24 : Classification immunologique des leucémies aigues lymphoblastiques T 80

82 Sous classification des LAL T : Figure 24 La sous classification des LAL T est moins bien précise à la base de la différenciation thymique normale. 4 sous groupes sont décrits par le groupe GEIL = groupe d étude immunologique des leucémies en France. LAL Pro T ou T I (CD7+) LAL Pré T ou T II (CD2+ ou CD5+ ou CD8+) LAL T cortical à T III (CD 10+) LAL T mature IV (CD3 (+) membranaire Classification des leucémies aiguës myéloblastiques : Tableaux VII et IX Les leucémies aiguës myéloblastiques sont définies par l expression de deux ou plus des marqueurs suivants = anti MPO, CD117, CD13 et/ou CD33 en absence de marqueurs spécifiques de la lignée lymphoïde. Les marqueurs les plus spécifiques de la lignée myéloïde sont anti MPO + suivi des CD 117 (159) (C Kit). Une étude récente multinationale coordonnée par le groupe GEIL a inclus 2000 cas de leucémie aiguë. L étude immunophénotypique a montré que les 2/3 des LAM et toutes les L.A indifférenciées expriment le CD117 par contre 4% uniquement des LAL expriment ce marqueur, mais elles expriment également d autres marqueurs de la lignée myéloïde et/ou correspondant à des LAL Pro T (early ALL). Le CD 117 est exprimé par une faible population de early thymocytes, qui sont, CD7+, CD 3-, CD4-, CD8-, CD117+, et sont capables de différencier en ligne lymphoïde T ou non lymphoïde (161). 81

83 A chaque sous type leucémique défini par le groupe FAB, correspond le plus souvent un profil phénotypique particulier mais non très spécifique. Quoi qu il en soit, seul trois sous types de LAM : M0, M6 et M7 sont définis sans équivoque par l immunophénotypage ( ). Tableau VII : Caractéristiques phénotypiques en fonction des sous types de leucémies aigues myéloïdes : M0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 CD ± - ± ± ± ± CD11c + + ± ± CD CD CD15 ± - ± ± ± ± ± - CD CD ± CD CD CD Glycophorine*A H.L.A DR* * Molécules non étiquetées en classe de différenciation Les leucémies aigues biphénotypiques : (Tableau VIII) L étude immunologique des leucémies aigues a permis d individualiser un groupe différent des formes communes dans lequel les cellules leucémiques expriment à la fois des marqueurs myéloïdes et lymphoïdes. Leur fréquence varie selon les études allant de 6 % à presque 30% des leucémies aigues étudiées. Il n existe pas de critères morphologiques ou immunologiques précis permettant la définition de ce groupe afin de faciliter le diagnostic, un système de score a été établit par le groupe EGIL en 1995 qui tient compte 82

84 de la spécificité et du nombre des marqueurs exprimés sur la membrane des cellules leucémiques (164). Ce système à été révisé en 1998 (161) (voir tableau VIII). Ce groupe est caractérisé par un mauvais pronostic comme le confirme le groupe EORTC. Le pronostic de cette entité est le même que celui des LA avec chromosome Philadelphie ou réarrangement 11q 23. (165). Tableau VIII : Système score des leucémies aigues biphénotypiques proposé par l EGIL Points Lignée B Lignée T Lignée myéloïde 2 CD IgM (cyt) CD3 (cyt/mb) Anti MPO CD 22 (cyt) Anti TCR /β Anti TCR δ / δ CD 19 1 CD 10 CD TdT CD 24 CD 2 CD 5 CD 8 CD 10 TdT CD 7 CD 1a CD 117 (C- Kit) CD 13 CD 33 CD 65s CD 14 CD 15 CD 64 La leucémie aigue biphénotypique est définie par un score à 2 points dans plus d une lignée B, T ou myéloïde Les leucémies aigues indifférenciées : Le groupe EGIL reconnaît un sous type rare de LA, dans lequel les cellules blastiques n expriment pas de marqueurs spécifiques de lignée, absence totale de marqueurs de différenciation cellulaire. (164) 83

85 Ces cas sont souvent CD 34 +/ classe II HLA DR+, CD 38, et CD 7(+). D autres décrivent les L.A. indifférenciés, qui n expriment pas les marqueurs spécifiques de lignée, sont souvent classe II (+), CD 34+ et TDT Les leucémies aigues inclassables : Il n existe pas de données suffisantes pour classer cette catégorie de L.A. 84

86 Tableau IX: Classification morphologique et Immunologique des leucémies aiguës non lymphoblastiques (165).European school of Haematology. LAM Mo Biphénotypiq ue LAM M1 LAM M2 - Myélopéroxydase négatives. - Immunophénotype : Absence de marqueurs lymphoïdes.. Marqueurs myéloïdes positifs. Immunophénotype : présence à la fois de marqueurs lymphoïdes et myéloïdes. - Blastes > 90% dans la moelle osseuse. - Myélopéroxydases positives > 3% des blastes. - Immunophénotype = marqueurs positif. Pourcentage de blastes dans la moelle osseuse entre 20 et 90% Monocyte < 20% - Prédominance des «promyélocytes Like» LAM M3 - M3 variant : même cellules sans granulation. Taux de monocytes dans la moelle osseuse > 20% et / ou dans le LAM M4 sang > 5 x 10 9 Taux de blastes > 20% dans M.O. Monocytes dans la M.O. > 80% des cellules non érythroblastes. LAM M5 M5 A = Forme indifférenciée (Monoblastes). M5 B = Forme différenciée (Monocytes / Promonocytes) Taux d érythroblastes dans la M.O. > 50%. LAM M6 Taux de blastes > 20% des cellules non érythroblastiques. M6 variant = Prédominance des proérythroblastes. LAM M7 Taux de mégacaryoblastes > 20%. 85

87 DEUXIEME PARTIE. ETUDE PERSONNELLE. 86

88 I- MATERIEL ET METHODES 1-Patients et critères d inclusion Cette étude prospective a porté sur 135 patients atteints de leucémie aigue, recrutés de janvier 98 à janvier 2003 au service d hématologie du centre Pierre et Marie Curie et de l hôpital central de l Armée. Les critères d inclusion sont :! Les patients adultes (âge >16 ans)! atteints de leucémie aigue de novo (jamais traités). Les critères d exclusion sont :! les antécédents de syndrome myélodysplasique ou autre pathologie hématologique. 2-Examens complémentaires Nous avons pratiqué chez tous ces malades de façon systématique un examen clinique, une radiographie thoracique, un hémogramme, un frottis sanguin et un médullogramme avec une étude cytologique et des colorations cytochimiques par la coloration des peroxydases ou du noir soudan ce qui a permis de classer nos patients selon la classification morphologique FAB. Une étude immunophénotypique par la méthode de cytométrie en flux est réalisée sur un prélèvement sanguin si la blastose sanguine est supérieure à 5000/mm3 ou bien sur un prélèvement de 2 a 3 ml de suc médullaire sur EDTA si la blastose sanguine est inférieure à 5000/ml3. Une ponction lombaire avec une étude cytologique du liquide céphalo-rachidien est réalisée dans les LAL, les LAM4 et les LAM5et les LA hyperleucocytaires. 3-ETUDE CYTOGENETIQUE : 3-1 Matériel. L étude cytogénétique est réalisée chez tous nos patients sur un prélèvement de 2 a 3 ml de suc médullaire prélevé de façon stérile à l aide d une seringue 87

89 héparinée que l on transvase immédiatement dans un tube cônique contenant un milieu de culture : RPMI + HEPARINE Equipement :! Hotte à flux laminaire! Incubateur a CO2! Centrifugeuse! Agitateur magnétique! Ph mètre! Bain-marie thérmostaté! Microscope à contraste de phase pourvu d un dispositif photographique! Laboratoire pour développement des photos en noir et blanc ou bien un système informatique d analyse et de traitement des images Réactifs :! Héparine sodique à 25000UI /5ml pan pharma! RPMI1640 sans glutamine Eurobio ref en 500ml! Peni-streptomycine! Lglutamine! SVF (sérum de veau foetal)! Colchicine SIGMA ref.c9754! KCL 0.75 M! Alcool méthylique (methanol)! Acide acétique glacial! Earle (solution de dénaturation prête à l emploi) sigma! Giemsa rapide RAL en 125 ml Consommables :! Tubes falcon 50 ml! Tubes de Greiner 88

90 ! Flasques à bouchon ventilé! Pipettes pasteur.! Portoirs tubes! Lames superfrost (à défaut des lames usuelles)! Pots en porcelaines! Pellicules noir et blanc 100 ou 200asa Milieux et solutions :! milieu de transport : RPMI+ HEPARINE! milieu de culture : RPMI 100ml+SVF 20ml+L glutamine 2cc+ peni-strepto 0,250 ml+héparine 1cc.! Colchicine : Lyophilisat de 1g à conserver a température ambiante Peser 100mg et ajouter 10ml d eau physiologique soit une concentration de 10mg/ml=D1. Diluer ensuite au 1/2000 en eau physiologique soit une concentration finale de 5ùg/ùl à conserver à ùl de D ùl d eau physiologique =D2 diluée au 1/20, puis 30ùl de D2+2970ùl eau= D3 diluée au1/2000! Kcl! Carnoy : solution de fixation Elle se prépare extemporanément et se conserve à +4 le temps de la technique : un volume d acide ascétique glacial + trois volumes d alcool méthylique (méthanol)! Earle : solution de dénaturation. Ref (5EARL4S balanced salts 6132 :10 l, 87.g /10 l Sigma)! Solution sulfochromique : traitement des lames 89

91 3.2. Méthodes : Technique de banding chromosomique. A. Ier JOUR Prélèvement : La moelle est prélevée par ponction sternale ou iliaque, 1 à 2 ml de suc médullaire sont aspirés, la première goutte permet de réaliser le frottis pour le myélogramme. Le reste du prélèvement est rapidement mis dans un milieu de transport, contenant du RPMI et de l héparine, homogénéisé et acheminé aussitôt au laboratoire Mise en culture : On prélève environ 0.5ml de moelle stérilement sous hotte et on fait une numération des cellules sur l automate d hématologie. Les cellules sont mises en culture dans un milieu synthétique sans adjonction de mitogène à raison de 2 millions de cellules/ml de milieu. Distribuer sous hotte et stérilement environ 4 à 5 ml de milieu de culture dans les flasques. En général trois flasques sont ensemencées pour une culture de 17h, 24h et 48h dans les LAM et une culture de 72h est rajoutées dans les LAL. Le nom et le prénom du malade ainsi que la date et le temps de culture sont inscrits sur chaque flasque. Ces dernières sont homogénéisées et mises couchées dans l incubateur a 37 C+5%CO2 en prenant la précaution d ouvrir les bouchons à un quart de tour pour permettre au CO2 d y pénétrer. B.2éme jour Blocage des mitoses : obtention des métaphases Une heure avant la date prévue de la sortie de culture, sortir les flasques, les homogénéiser et ajouter sous hotte 100ùl de colchicine, prête à l emploi (diluée au 1/2000) dans chaque flasque. Homogénéiser à nouveau et replacer dans l incubateur 90

92 Choc hypotonique : faire éclater les mitoses Préchauffer la solution de KCL0.075 molaire à 37 pendant le blocage. «A partir de ce moment, il n est plus nécessaire de travailler stérilement.» Sortir les flasques de l incubateur, transvaser chacune d elles dans des tubes coniques Falcon de 15 ml, les identifier par le nom, le temps de culture (17,24, 48, et 72heures) ainsi que la date de mise en culture. Puis centrifuger à température ambiante 10mn à 1000 tours. Après centrifugation on obtient un culot et un surnageant coloré, on élimine le maximum de surnageant à l aide d une pipette pasteur, on remet le culot en suspension et on ajoute le KCL préchauffé goutte à goutte tout en agitant avec la pipette pasteur par des mouvement d aspiration et d éjection rapides. Le choc doit être à la fois mécanique et thermique. On remet les tubes dans l incubateur à 37 pendant 30 minutes. Pendant ce temps, on prépare la solution de fixation Fixation On prépare la solution de carnoy : méthanol 3V+acide acétique 1V en quantité suffisante pour 3 à 4 fixations soit 3 à 4 x 10ml/ tube. Les tubes sont retirés de l étuve à la fin du choc et centrifugés 5mn à 1000 tours, on retire le surnageant et on ajoute progressivement le carnoy tout en remettant en suspension et on centrifuge 5mn à 1000 tours. On réalise un minimum de 3 fixations jusqu'à obtenir un culot clair et un surnageant clair. 91

93 Etalements des culots cellulaires A la dernière fixation, retirer le surnageant en laissant une partie suffisante pour remettre le culot en suspension (la quantité de carnoy sera plus ou moins importante suivant l épaisseur du culot). Prélever une petite quantité avec une pipette pasteur munie d une poire. Sur papier humide, poser les lames, déposer une goutte de l effilure de la pipette sur lame, surveiller son étalement par le phénomène d irisation de la goutte qui diffuse sur la lame, puis retirer la lame et la déposer sur un papier sec (Idéalement réaliser les étalements dans une pièce ou le degré hygrométrique est proche de 40% et une température n excédant pas 24 ). Dans un premier temps, on réalise un seul étalement par tube et par malade et on apprécie au microscope à inversion la présence et la qualité des mitoses. Dans un deuxième temps on décide la réalisation d autres lames qu on identifie par le nom, le temps de culture et la date Dénaturation Dans notre travail nous avons utilisé la technique de banding chromosomique classique obtenue après dénaturation par la chaleur (bandes R : RHG). Les lames sont dénaturées 24 à 48heures après leur étalement. On préchauffe le bain marie à 87, entre temps on prend le PH de la solution Earle qui doit être de 5,8. On verse cette solution dans un pot en porcelaine qu on place dans le bainmarie et on attend que la température soit stabilisée à 87. On introduit un maximum de 8 lames par pot et par dénaturation Le temps de dénaturation est très important et de lui va dépendre la qualité du banding chromosomique. Ce temps est très aléatoire et dépend de l hygrométrie et de la température ambiante, il doit être adapté à chaque nouvelle dénaturation. Nous avons testé quelques lames initiales avec des temps de dénaturation compris entre 70 et 90 minutes et après avoir apprécié la qualité de la dénaturation au microscope, nous avons ajusté ce temps suivant le stade de 92

94 dénaturation obtenue. Il est en général compris entre 80 et 85 minutes pour tout les cas étudiés. A la fin de la dénaturation on stoppe aussitôt cette dernière en plongeant les lames rapidement dans un bain d eau froide(eau du robinet ) puis dans un bain d eau distillée et enfin on les contre colore au Giemsa rapide, préparé extemporanément 10 minutes avant la fin de la dénaturation. Apres une coloration de 5 à 10 minutes les lames sont rincées à l eau courante, égouttées et séchées Prise de photos et interprétation : Pour réaliser cette partie du travail nous avons été aidés par l équipe de cytogénétique du laboratoire d hématologie de l hôpital Avicenne (Paris). Un système informatique conçu pour analyser et traiter les images (Applied imaging) est utilisé muni d un logiciel intitulé : Caryosystème couplé à une caméra permettant d observer les mitoses de la lame regardée. Ces mitoses sont capturées et enregistrées avec leur côte et information de temps de culture. Le classement des chromosomes est fait à la fois de façon automatique par le logiciel et par nous même après avoir agrandi et imprimé l image de la mitose sur papier. (Voir planche VIII) Interprétation du caryotype : a - Nomenclature : Pour exploiter nos résultats, nous avons fait appel à la nomenclature cytogénétique internationale (ISCN) qu on rappelle brièvement :! caryotype normal : 46, XX ou 46, XY point de cassure sur un chromosome désigné successivement par : P ou q : bras court ou bras long. Les n région, n bande, n sous bande.! Anomalies numériques établies à partir caryotype normal diploïde 93

95 (2n) à 46 chromosomes : Perte ou gain (monosomie ou trisomie). Degré de ploïdie (diploide2n, hypodiploide <46 ou hyperdiploïdes >46 chromosomes, haploïde n, triploïde 3n).! Anomalies structurales : Portant sur un chromosome (délétion, inversion, duplication, iso chromosome). Portant sur deux ou plusieurs chromosomes (translocation simple ou complexe). b -Interprétation Pour interpréter nos résultats, il convient d avoir 10 à 20 mitoses analysables par malade et tenir compte des critères de clonalité définis par le 4éme workshop international sur les chromosomes (Fourth international workshop on chromosomes in leukaemia) (14). Un clone est défini par deux cellules au moins, possédant le même chromosome surnuméraire ou la même anomalie de structure, ou trois cellules au moins lorsqu il y a la perte d un même chromosome. Les patients, ayant un nombre de mitoses inférieur à 10 ou des mitoses de mauvaise qualité non analysables, sont exclus de l étude. On considère qu une anomalie est primaire si elle est présente dans toutes les cellules du clône leucémique et secondaire si elle est surajoutée à l anomalie primaire. 94

96 4-Suivi des patients : Les patients sont évalués par l obtention d une rémission complète suite au traitement d induction et ultérieurement par la médiane de survie. La rémission complète est définie par : un examen clinique normal. un hémogramme et un frottis sanguin normaux. Un taux de blastes médullaire inférieur à 5%. La médiane de survie est definie par le temps t pour lequel la probabilité de survie S (t) est égale à 0,5. 5-Etude statistique : les tests utilisés sont : 1. Test comparaison d un pourcentage observé a un pourcentage théorique. 2. Test du X2 et le test du X2 corrigé de yates lorsque les effectifs théoriques sont inférieurs Test de comparaison de deux moyennes. 95

97 II. Résultats 2. Etude descriptive des patients : 135 patients sont inclus dans notre étude selon les critères définis par le groupe FAB, 105 sont inclus dans le groupe de LANL et 30 dans le groupe des LAL. L étude cytogénétique n a pu être réalisée que chez 33% des patients (n=45).dans 67%des cas (n=90) l étude n a pas été possible : prélèvement insuffisant (n=8), contamination par des levures ou des bactéries (n=12), absence de pousse cellulaire à la culture (n=24), erreur technique : utilisation de l éthanol au lieu du méthanol lors de la fixation (n=2), le nombre de mitoses analysables est insuffisant ou de mauvaise qualité, technique impossible a interpréter (n=44). Ce taux d échec n est que de 20% à 40% selon les données de la littérature et la différence avec nos résultats est très significative ( e =4,7), ceci explique la difficulté de mise au point de cette technique qui requiert une certaine expérience afin de bien maîtriser les différentes étapes nécessaires à l obtention de mitoses de bonne qualité, en tenant compte de la fragilité des cellules leucémiques caractérisées par des chromosomes boudinés et frisottés, rendant compte de la difficulté de réalisation du caryotype hématologique contrairement au caryotype constitutionnel( ). L absence de pousse cellulaire à la culture est constatée dans 24cas, dans 16 cas il s agit d une LAL. Nous avons constaté que les cellules des LAL poussent moins bien que celles des LAM. Ceci est également rapporté par A.Bernheim (7) et par le first MIC cooperative study group (65) en raison des difficultés techniques. En effet, les cellules sont très fragiles et le moindre retard dans les séquences des techniques peut compromettre le résultat (2, 3). Vu le nombre réduit de notre échantillon nous avons inclus dans notre étude 15 patients algériens dont le caryotype a été effectué en France. De ce fait notre étude porte sur 60 patients. Selon des critères définis par le groupe FAB : 22 sont inclus dans le groupe des LAL et 38 dans le groupe des LANL. 96

98 Les anomalies cytogénétiques sont retrouvées chez 56 % de l ensemble des patients (n=34). Ce taux varie entre 50% et 80% selon les séries publiées dans la littérature, ce qui est en accord avec nos résultats (e=1,16) leucémies aigues myéloblastiques caractéristiques cliniques des patients :! 38 patients sont inclus dans ce groupe, 15 de sexe féminin et 23 de sexe masculin avec un sexe ratio m /f=1,5. L âge moyen est de 37 ans avec des extrêmes de 16 à 84 ans.! Le syndrome tumoral est retrouvé dans 12 cas (31.5%), il s agit de splénomégalie dans 2 cas (5%), d adénopathies dans 7 cas (18%), une infiltration cutanée dans un cas, une hypertrophie gingivale dans 3cas (7%) retrouvée essentiellement dans les LAM de type M4 et M5. Une atteinte neuro-méningée est retrouvée dans 2 cas (5%), il s agit de LAM Les caractéristiques biologiques : La répartition des 38 patients dans les sous groupes de la classification FAB est la suivante : LAM0 : 3cas, LAM1 : 8cas, LAM2 :13 cas, LAM3 : 3 cas dont une M3 variante, LAM4 :6 cas, LAM5 : 3cas, LAM 6 : 1 cas et un cas de LAM de type indéterminé. Globules blancs : le taux moyen des globules blancs est 21467/mm3, Dans la série du Dr TRABZI (166) le taux est de 51747/mm3. Six patients (15%) ont un taux de globules blancs supérieur à /mm3, 3 cas : LAM2, 2 cas : LAM5, 1 cas : LAM0. Plaquettes : 26 malades (68%) ont un taux de plaquettes inférieur à /mm3, 9 patients (23%) ont un taux inférieur à / mm3 et nous avons constaté une CIVD dans 3 cas de LAM3. Dans la série de TRABZI 87% ont un taux inférieur à (166) 97

99 et de 67% dans la série de SOLARY(167). Hémoglobine : le taux moyen d hémoglobine est de 7 g/dl avec des extrêmes allant de 2,5 à 13 g/dl, 92 % des patients ont un taux d hémoglobine inférieur à 10 g/dl, la proportion est de 96 % dans la série de SOLARY (167) et de 94 % dans celle de TRABZI (166). Immunophénotypage : l étude immunophénotypique a permis de conforter le diagnostic des sous groupes FAB de leucémie aiguë par la mise en évidence des antigènes respectifs dans 34 cas soit 89 %. Dans 4 cas l étude morphologique ainsi que les colorations cytochimiques n ont pas permis de classer la leucémie aiguë et c est l étude immunophénotypique qui a permis de les classer dans le sous groupe des LAM0 : 3 cas et dans un cas il s agit d une leucémie aiguë biphénotypique. Dans cinq cas nous avons constaté une co-expression d un antigène lymphoïde de la lignée B (13 %), il s agit dans tous les cas d un CD 19 + retrouvé dans une LAM0, LAM1, LAM2 et LAM L analyse cytogénétique : Sur un échantillon de 38 patients, le caryotype est normal dans 20 cas (53%) et a montré des anomalies cytogénétiques dans 18 cas (47%). Ce taux est de 50% à 70% selon les données de la littérature [7]. Nos résultats sont en accord avec ces dernières (e <1,96). Nous avons mis en évidence des anomalies non aléatoires spécifiques de certains types FAB dans 9 cas soit : 50% des cas anormaux, ce taux rejoint celui de la littérature qui est compris entre 35 à 40% (7) (e<1,96). Il s agit dans 6 cas d une t (8-21) retrouvée dans les LAM de type M2 et dans 3 cas d une t (15-17) retrouvée dans les LAM de type M3. Les autres anomalies non spécifiques mais récurrentes sont mises en évidence dans 9 cas soit 50% des cas anormaux. Ce taux est de 34% à 40% des cas anormaux dans les données de la littérature [7], ces taux sont également 98

100 superposables et (e<1,96). Dans ce groupe nous avons mis en évidence une perte de l Y dans 2 cas, une trisomie 8 dans 3 cas, une monosomie 5 dans 2 cas ; une monosomie 7 dans un cas et enfin un caryotype complexe dans 1 cas : ( X) 48 X. Les fréquences des anomalies cytogénétiques retrouvées dans notre série sont résumées dans le tableau X, en comparaison avec la littérature. 99

101 Tableau X : Fréquence des anomalies cytogénétiques retrouvées dans notre série en comparaison avec les données de la littérature. Anomalies Nombre Type FAB Fréquence en % Signification cytogénétiques Notre série Littérature t (8 ; 21) 06 LAM2 : IeI = 1.3 non significative t (15 ; 17) 03 LAM 3 : IeI = LAM 3 v1 non significative - Y 04 LAM 2 : 2 LAM 5 : IeI = 6.25 significative Trisomie 8 06 LAM 1 : IeI = 0.6 LAM 2 : 4 non LAM 3 : 1 significative Monosomie 7 01 LAM IeI = 1.77 non significative Monosomie 5 02 LAM IeI = 1.35 Del 5q LAM 1 non significative Caryotype complexe X, +8, +15, LAM 2 Biphénotypique IeI 4.3 Significative 100

102 Analyse des patients présentant une t (8 ; 21) : (Voir planche IV) Sur 38 patients, 13 présentent une LAM de type M2, dont 6 présentent une t (8-21). Cette anomalie représente dans notre étude 15 % de l ensemble de LAM, ce qui rejoint les données de la littérature puisque ce taux est de 6 à 12% e = 1.3. Cette anomalie représente 46 % des LAM2, alors que ce taux n est que de 15% dans la littérature, Cette différence est significative (e >1.96) et expliquée par l effectif réduit de notre échantillon. L âge de ces six patients est de 17, 21, 22 et 23 ans, un seul est âgé de 48 ans. Toutefois, tous ces patients ont un âge inférieur à 50 ans, en effet cette anomalie est rare après 50 ans. Il s agit de 5 hommes et une femme. Le taux moyen des globules blancs est de : Les caractéristiques cliniques et biologiques sont résumées dans le tableau (XI). On note la présence d une localisation extra médullaire dans 1 seul cas, il s agit d une infiltration cutanée. Dans 5 cas soit 83%, l infiltration blastique médullaire est massive supérieure à 80 %. L aspect morphologique des cellules blastiques est le même dans les 6 cas, il s agit de cellules de grande taille avec un cytoplasme abondant contenant des granulations et des bâtonnets d Auer, cet aspect est décrit par George FLANDRIN (169) et il est prédictif, quand il est retrouvé, de l existence d une translocation (8-21). (Fig. 25). 101

103 Figure 25 : LAM2 avec t (8 ; 21) L immunophénotypage dans cette série de malades montre la positivité fréquente des marqueurs CD 33, CD 34. On ne remarque pas dans cette série de co-expression d antigènes lymphoïdes B CD 19, contrairement à ce qui est dit dans la littérature [8-170]. Nous retrouvons des anomalies additionnelles dans 3 cas soit : 50 %, il s agit de la perte d un chromosome sexuel dans 2 cas (-Y) : 33 % et d une trisomie 8 dans 01 cas. La biologie moléculaire est pratiquée chez un seul patient, elle a permis de mettre en évidence le réarrangement du gène AML1/ ETO. 102

104 103

105 Caractéristiques des patients présentant une translocation (15 ; 17). :(voir planche XI) Dans notre série, 3 patients présentent une LAM de type M3 dont une est une LAM3 variante, nous retrouvons la t (15 ; 17) dans les 3 cas soit 7,8% des LAM et 100% des LAM3, Selon Francine MUGNERET et Christiane CHARRIN [168], cette anomalie est retrouvée dans 6 à 11 % des LAM et 90 % des LA promyélocytaires. Nos résultats rejoignent ceux de la littérature IeI = 0.13 Il s agit de 3 patientes, âgées de 22, 52 et 68 ans, un syndrome hémorragique avec une thrombopénie est noté chez les malades. Une coagulopathie intravasculaire disséminée (CIVD) biologique est retrouvée dans les trois cas. Avec des taux bas de fibrinogène et une augmentation des produits de dégradation du fibrinogène. Nous retrouvons une leucopénie dans 2 cas sur 3 soit : 66% et dans le dernier cas, une hyperleucocytose à /mm3, il s agit de la M3-variante. L aspect morphologique des blastes : est caractéristique, on constate un envahissement médullaire massif par les blastes allant de 67 à 100 %. Il s agit dans les 2 cas de blastes hypergranulaires de couleur pourpre avec un noyau réniforme irrégulière donnant un aspect bilobé avec de nombreux bâtonnets d Auer (voir fig26.) Dans le 3 e cas (M3-variante) la granulation est discrète, le noyau est réniforme et le cytoplasme est abondant. (Voir fig27 et 27 bis.). La coloration cytoplasmique montre une forte positivité à la MPO (100% blaste) dans les 3 cas. Les caractéristiques cliniques et biologiques sont résumées dans le tableau (XII). L immunomarquage retrouve dans les 3 cas une positivité du CD33 et CD 13, avec la négativité des Ag : HLA DR et CD 34. Nous n avons pas constaté de coexpression de marqueurs lymphoïdes ni CD2 ni CD19 comme on le retrouve dans la littérature dans les LAM3 avec t (15 ; 17) [ ], mais le nombre de cas de notre série est trop réduit pour conclure. 104

106 Dans un cas sur 3 nous avons retrouvé une anomalie additionnelle, il s agit d une trisomie 8. Cette anomalie est retrouvée dans 1/3 des cas [7-19] selon les données de la littérature. La biologie moléculaire est faite dans 1 seul cas, c est le type M3-variante et on a retrouvé le réarrangement PML / RAR α de type BCR 2. Fig. 26 :LAM3 avec t (15 ; 17) : a)-promyélocyte avec des bâtonnets d Auer en fagots. b)-promyélocytes avec granulations et bâtonnets d Auer a b Figure 27 LAM 3 variante. Figure 27 bis LAM3 microgranulaire 105