Chromatographie en Phase Liquide. Phase normale et inversée. Liquid Phase Chromatography. Normal and Reversed Phase

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1 Chromatographie en Phase Liquide Phase normale et inversée Liquid Phase Chromatography Normal and Reversed Phase

2 Chromatographie d adsorption Phase normale

3 Chromatographie d adsorption Phase stationnaire : silice ou alumine Phase mobile : solvants organiques peu ou moyennement polaires Mécanisme : adsorption Interactions polaires : liaisons hydrogène et interactions dipolaires Contrainte : contrôle de la teneur en eau des solvants et de la phase stationnaire Méthodologie inadaptée à l analyse des protéines

4 S: molécule de soluté M: molécule de phase mobile silice: caractère acide séparation de composés basiques alumine + adaptée pour la séparation de composés acides Ordre d affinité pour les molécules monofonctionnelles: Hydrocarbures saturés, hydrocarbures insaturés, hydrocarbures aromatiques, éthers, composés nitrés, esters, cétones, alcools, amides, acides carboxyliques

5 Influence de la surface spécifique 470 m 2 g m 2 g -1 1 toluène 2 naphtalène 3 biphényle 4 anthracène 5 phénanthrène 900 m 2 g -1 Adapté de Rosset et al. Manuel pratique de chromatographie en phase liquide

6 Chromatographie d adsorption - Force éluante d un solvant 0 L énergie d adsorption est définie par rapport au pentane, pour lequel une énergie d adsorption nulle est fixée arbitrairement

7 Chromatographie de partage Utilisation de gels de silice greffés par des molécules variées La séparation est fonction des différences de solubilité des solutés entre phases mobile et stationnaire partage classique (mode normal) partage à polarité de phases inversée

8 Phases stationnaires greffées Silice fonctionnalisée : résistance mécanique, granulométrie, efficacité des colonnes Réactivité des silanols Stabilité entre 2 < ph < 7,5-8 Liaisons: Si-O-C Si-C Si-O-Si-C

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10 Partage en polarité de phase inversée Phase stationnaire : silice greffée apolaire (hydrophobe) ou polymère apolaire (copolymère divinyl benzène-styrène, pas de silanols) Phase mobile : mélange eau solvant organique ajustement du ph (milieu tamponné) Eau << Méthanol < acétonitrile < THF Mécanisme : effets hydrophobes

11 Caractérisation des supports: nature du greffon concentration du greffon par unité de surface pureté des greffons nature de la greffe «endcapping»

12 Réaction de silylation supports stables thermiquement et vis à vis de l hydrolyse Stabilité hydrolytique des phases greffées Influence du groupe R

13 Facteurs influençant la rétention Nature du soluté (caractère hydrophobe) Nb de chaînes alkyles greffées N/nm 2 silice Surface des chaînes alkyles greffées S Surface hydrocarbonée greffée (NS) S = 0,13 + 0,225 n (nm 2 ) pour un greffon à n atomes de carbone log k est proportionnel au produit NS Nature du solvant organique Composition eau solvant organique Force ionique de la phase mobile Température

14 Adaptation du support pour l analyse des protéines : Nature du greffon : greffage C1 à C4 Surface spécifique inférieure à 300 m 2 /g Porosité : 0,3 nm «endcapping» pour une activité minimale

15 Adaptation du mode d analyse pour la séparation des protéines : adsorption sur la phase stationnaire en conditions non éluantes : eau + acide volatil (HCOOH 0,1% ou acide trifluoroacétique (effet de paires d ions)) Elution en mode gradient avec un modifiant organique : acétonitrile, isopropanol

16 Choix du modifiant organique : acétonitrile plus dénaturant que l isopropanol force éluante supérieure de l isopropanol, mais forte viscosité

17 PARTICULARITE Pente du gradient de modifiant organique : c est la vitesse de variation de la composition de l éluant qui fixe la résolution du système, pas la longueur de colonne pour les protéines, un gradient trop lent (< 1 % par minute par exemple) provoque un fort élargissement des pics (sites d interaction multiples de la protéine ), alors qu un gradient trop rapide peut ne pas être assez résolutif

18 APPLICATION PARTICULIERE Dessalage rapide : les sels sont élués dans le volume mort Concentration : en conditions non éluantes, des volumes très supérieurs au volume de colonne peuvent être injectés. L élution avec une montée très rapide du gradient permet d éluer la protéine dans un petit volume de solvant volatil Risque majeur : dénaturation

19 Phases Stationnaires à base de polymère matrice: polymère en poudre plus de problème de silanols stabilité en ph pas de traînées de pics, moins bonne efficacité