La protéomique. Emilie Pinault & Karine Vuillier-Devillers. 25 mai

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1 La protéomique Emilie Pinault & Karine Vuillier-Devillers 25 mai

2 Plan La protéomique : objectifs, applications et stratégie Approche gel 2D : les étapes, ses contraintes, ses limites Technique 2D-DIGE La spectrométrie de masse La méthode générale d analyse d un échantillon Quelques applications Bilan technique du plateau Mises au point gel 2D et tests Coût consommables gel 2D Détermination de la sensibilité du spectromètre de masse Identification de protéines 25 mai

3 La protéomique Ensemble des PROTEines exprimées es par un génome Homme : ~ gènes g ~ transcrits ~ protéines La cellule : en constante évolution sous la direction ou l influence de son patrimoine génétique, son environnement, à un événement : pathologie, mutation d un gène, 1 génome g pour des protéomes omes 25 mai

4 La protéomique «Photographie» de l ensemble l des protéines cellule, tissu, organite à un instant t dans des conditions données Identification des protéines Mieux comprendre les interactions : gènes, protéines et environnement 25 mai

5 3 approches protéomiques Criblée Cibler et identifier une/des protéine(s) d intérêt Systématique Analyse de l ensemble d un protéome ou d un sous protéome Différentielle quantitative Comparaison de plusieurs conditions Quantification Analyse des variants 25 mai

6 Les applications protéomiques Comparaison différentielle directe d éd échantillons protéiques complexes Identification de nouveaux partenaires/complexes Mise en évidence des modifications post-traductionnelles traductionnelles Diagnostic clinique : identification de biomarqueurs Analyses toxicologiques 25 mai

7 Stratégie générale Extraction des protéines Protéome total Fractions subcellulaires Séparation en plusieurs dimensions Fractionnement Chromatographies liquides (échange d ions, phase inverse ) Cartographie Électrophorèse 1D et 2D Western Blot Identification des protéines Mesure des masses par MALDI-TOF Séquençage par nano-lc MS/MS 25 mai

8 Approche gel 2D : les étapes, ses contraintes, ses limites 25 mai

9 Electrophorèse bidimensionnelle 1. Préparation de l échantillon 2. IEF 12 gels : 7 à 24 cm 3. SDS-PAGE 6 gels : 24*26 cm 10*10.5 cm 4. IDENTIFICATION DES PROTEINES 25 mai

10 Préparation de l échantillon 1. Extraction des protéines * sonication pour les cellules * broyage pour les tissus (mortier dans azote liquide) 2. Purification de l extrait l et concentration enlever les molécules interférentes (sels, lipides, ADN etc..) précipitation à acétone/ethanol, TCA Concentration > 3µg/µl 3. Dénaturation D et solubilisation complète des protéines dans le tampon IEF : urée, CHAPS, DTT, et IPG buffer Etape clé de l analyse 2D 25 mai

11 Isoélectrofocalisation (IEF) séparation des protéines en fonction de leur phi dans un gradient de ph (strip) Gradient et longueur de la strip des protéines, de la quantité à déposer, analyse préparative ou analytique, révélation Réhydratation de la strip ph 10 - ph cm, 2< ph< 12 12h à 20 C chargement dans cupule Migration Focalisation des protéines :~ 15h (kvh) Montée en voltage par gradients et paliers jusqu à V Échantillon, gradient, longueur 25 mai

12 2 ième dimension : SDS-PAGE séparation des protéines en fonction de leur taille dans un gel vertical 200 kda Equilibration de la strip 2 bains sous agitation dans tampons : urée, CHAPS, SDS, DTT Gel à 10 ou 12% de polyacrylamide 4h migration 20 kda 25 mai

13 Les techniques de révélation Méthode Sensibilité Compatibilité Quantification MS BC R ng OUI OUI BC Colloïdal (G250) ng OUI OUI Nitrate d argent 1 ng NON NON SYPRO Ruby 1 2 ng OUI OUI Cy2, Cy3, Cy5 DIGE 0,1 1 ng OUI OUI 25 mai

14 Numérisation des gels Scanner Amersham : gels colorés Bleu Coomassie, Nitrate Argent etc.. Logiciel Image Master Platinum PhosphofluoroImager Amersham : TYPHOON Marqueurs radioactifs, fluorescents et luminescents: gels d électrophorèse, membranes de transfert, plaques de microtitration, Microarray (logiciel Image Quant) Multiplexage (marquage par les cyanines 2D- DIGE : logiciel Decyder) 25 mai

15 Détection et Quantification des spots Volume du spot = quantité protéique 25 mai

16 Technique 2D-DIGE 25 mai

17 Cy3 Stratégie 2D DIGE Two Dimensional Difference Gel Electrophoresis Cy5 Liaison au niveau des résidus Lysine Cy TM 2 Pooled internal standard label with Cy 2 Cy2 Protein extract 1 label with Cy3 Cy3 Protein extract 2 label with Cy5 Cy5 Préparation 3 échantillons : 400 pmoles 50 µg protéines Pool des échantillons 2-DE Separation 150 µg/gel Typhoon 3 scans/gels λ spécifiques Logiciel Decyder 25 mai

18 Analyse des spots : logiciel Decyder ❶ DIA «Differential In gel» Quantification des spots issus d échantillons par rapport au standard interne ❷ BVA «Biological Variation Analysis» Analyse différentielle et Matching des gels (Normalisation avec création d 1 standard référens) 25 mai

19 Protéines très hydrophobes Protéines <10 kda et >200 kda Protéines faiblement abondantes Limites de la 2D Protéines d intérêt exemple du plasma humain Gel 2D : séparation 2000 protéines Les cellules peuvent exprimer jusqu à protéines 25 mai

20 Contraintes Pureté des échantillons et solubilité des protéines Produits de Haute Qualité (eau) Environnement dépourvus de Kératine Difficulté de reproductibilité : pour gel 2D classique 25 mai

21 La spectrométrie de masse La méthode générale d analyse d un échantillon Quelques applications 25 mai

22 Stratégie générale Extraction des protéines Protéome total Fractions subcellulaires Séparation en plusieurs dimensions Fractionnement Chromatographies liquides (échange d ions, phase inverse ) Cartographie Électrophorèse 1D et 2D Western Blot Identification des protéines Mesure des masses par MALDI-TOF Séquençage par nano-lc MS/MS 25 mai

23 Protocole général de l analyse par nano-lc MS/MS Etape 1 : Excision des spots ou des bandes à partir de gels colorés au bleu de Coomassie KERATINE Etape 2 : Digestion des protéines utilisation de trypsine (clivage après Lysine et Arginine) 0,90 par spot 2D 1,80 par bande 1D 1 échantillon = 3H de digestion KERATINE Etape 3 : Identification par spectrométrie de masse couplage nano-chromatographie liquide avec de la MS/MS 1 échantillon = 1H30 de nano-lc MS/MS + 2H de bio-informatique 32 par analyse nano-lc MS/MS 25 mai

24 Les appareils Nano-chromatographie liquide Spectromètre de masse Q-TRAP Station d'acquisition des données + Station d analyse des données 25 mai

25 La nano-chromatographie liquide (Dionex) Injection automatique des échantillons Injection de 1 à 20 µl d'échantillon Séparation des peptides selon l'hydrophobicité (colonne phase inverse) Débit de 200 nl/min 25 mai

26 Le spectromètre de masse Q-TRAP (Applied Biosystems) Analyses MS et MS/MS Masse des peptides Séquence des peptides en acides aminés 25 mai

27 La méthode d acquisition Arrivée en continu de la nano-lc Mesure du courant ionique total 25 mai

28 Mesure du courant ionique total ~ "chromatogramme" Ex : Digest de cytochrome c Gradient ACN Intensité (cps) Temps (min) 0 25 mai

29 La méthode d acquisition Arrivée en continu de la nano-lc Scan rapide des masses des ions Masse des peptides 25 mai

30 Masse des peptides = spectres MS Ex : Digest de cytochrome c t = 32,563 min Intensité (cps) m/z (amu) Sélection des 2 ions les plus intenses 25 mai

31 La méthode d acquisition Arrivée en continu de la nano-lc Scan rapide des masses des ions Scan précis des 2 ions les plus intenses Détermination de la charge des peptides 25 mai

32 Détermination de la charge des peptides Ex : Digest de cytochrome c t = 32,599 min Massif isotopique de l ion 454,5 Intensité (cps) m entre pics = 0,5 peptide doublement chargé Masse du peptide = 906,98 Da m/z (amu) 25 mai

33 La méthode d acquisition Arrivée en continu de la nano-lc Scan rapide des masses des ions Scan rapide après fragmentation de ces 2 ions Scan précis des 2 ions les plus intenses Masse des fragments pour chaque peptide 25 mai

34 Masse des fragments pour chaque peptide = spectres MS/MS Ex : Digest de cytochrome c t = 32,62 min Spectre de fragmentation de l ion 454,5 2+ Intensité (cps) m/z (amu) 25 mai

35 La méthode d acquisition Arrivée en continu de la nano-lc 0,6 sec Scan rapide des masses des ions 2 sec Scan rapide après fragmentation de ces 2 ions cycles de 3 sec Scan précis des 2 ions les plus intenses 0,4 sec Sur 1H30 d analyse : ~ 1800 cycles 1800 spectres MS 3600 spectres MS/MS 25 mai

36 Analyse des données : utilisation du logiciel MASCOT Analyse par nano-lc MS/MS Masses des peptides + Masses des fragments pour chaque peptide MASCOT Séquence des peptides en acides aminés 25 mai

37 Exploitation des spectres MS/MS Ex : Digest de cytochrome c t = 32,62 min Spectre de fragmentation du pic 454,5 2+ Ion précurseur [M+H] + = 907,9 M I F A G I K K Intensité (cps) 275 KK/QK I/L 57 G 71 A 147 F 113 I/L 131 M m/z (amu) Attribution d un score pour chaque peptide : Fonction de l exactitude des masses Fonction du nombre total de pics attribués 25 mai

38 Analyse des données : utilisation du logiciel MASCOT Analyse par nano-lc MS/MS Banques de données Masses des peptides + Masses des fragments pour chaque peptide Protéines toutes espèces espèce particulière MASCOT Digestion in silico Séquence des peptides en acides aminés SCORE Par comparaison Peptides toutes espèces espèce particulière MASCOT Identification des protéines SCORE Validation si > mai

39 Analyse des données : utilisation du logiciel MASCOT Ex : Digest de cytochrome c 8 peptides séquencés sur 27 peptides prédis par le logiciel Mascot Couverture de séquence : 50% 1 GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV EKGGKHKTGP NLHGLFGRKT GQAPGFSYTD 51 ANKNKGITWG EETLMEYLEN PKKYIPGTKM IFAGIKKKGE REDLIAYLKK 101 ATNE 25 mai

40 Quelques applications Quantification de l expression protéique Analyse des modifications post-traductionnelles 25 mai

41 Quantification en MS identification en MS/MS Principe : introduire une différence de masse entre les mêmes peptides de conditions différentes Marquage métabolique SILAC (Stable Isotope Labelling with Amino Acids in Cell Culture) Utilisé pour des cellules en culture uniquement Plusieurs conditions analysables en même temps Incorporation d acides aminés marqués isotopiquement La différence de masse dépend de l acide aminé incorporé Condition A Condition B 6 Da 12 C 6 -Lys 13 C 6 -Lys 10 Da 12 C 6-14 N 4 -Arg 13 C 6-15 N 4 -Arg 25 mai

42 Quantification en MS identification en MS/MS Marquage ICAT (Isotope-coded affinity tagging) Incorporation d un tag léger ou lourd de façon covalente sur les cystéines Biotine C 10 H 17 N 3 O 3 Groupement réactif ( SH) Léger : 10 x 12 C 9 Da Lourd : 9 x 13 C + 1 x 12 C Permet un préfractionnement sur colonne d affinité streptavidine ou avidine 2 conditions uniquement Dépend de la proportion en cystéines dans les protéines 25 mai

43 Quantification en MS identification en MS/MS Pour chaque peptide : 2 groupes de pics m/z caractéristique Séparés par un m/z caractéristique du type de marquage Calcul des ratios des peptides Intensité pic Cond B Intensité pic Cond A Cond A Cond B Ratio d une protéine = moyenne des ratios de ses peptides >1 augmentation <1 diminution 25 mai

44 Quantification et identification en MS/MS Principe : utilisation de 4 tags de même masse mais de compositions différentes Marquage itraq (isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation) Liaison covalente sur les amines primaires (N-terminal + lysines) Tags de 145 Da Un seul signal pour chaque peptide sur les spectres MS Cond A 145 A T G R Cond B 145 A T G R Cond C 145 A T G R Cond D 145 A T G R Ross, P.L. (2004) Mol. Cell. Proteomics 3: mai

45 Quantification et identification en MS/MS Principe : utilisation de 4 tags de même masse mais de compositions différentes Marquage itraq (isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation) Liaison covalente sur les amines primaires (N-terminal + Lysines) Tag de 145 Da Un seul signal pour chaque peptide sur les spectres MS Apparition de 4 ions rapporteurs après fragmentation ratios Cond A Cond B Cond C Cond D A T G R A T G R A T G R A T G R Ross, P.L. (2004) Mol. Cell. Proteomics 3: mai

46 Applications Quantification de l expression protéique Analyse des modifications post-traductionnelles 25 mai

47 La méthode d acquisition Arrivée en continu de la nano-lc Scan rapide des masses des ions Spectres MS Logiciel MIDAS Scan rapide après fragmentation de ces 2 ions Scan précis des 2 ions les plus intenses Spectres MS/MS 25 mai

48 Analyse des modifications post-traductionnelles 25 mai

49 Analyse des modifications post-traductionnelles Séquence de la protéine Modification post-traductionnelle Digestion in silico de la protéine Localisation de tous les sites potentiels de modification 25 mai

50 Analyse des modifications post-traductionnelles Liste des peptides Colonne 1 : avec modification Colonne 2 : sans modification Séquençage des acides aminés 25 mai

51 Analyse des modifications post-traductionnelles Liste des peptides Colonne 1 : avec modification Colonne 2 : sans modification mai

52 Analyse des modifications post-traductionnelles Il est nécessaire de connaître : La séquence de la protéine cible La masse de la modification post-traductionnelle à étudier Analyse plus complexe pour les glycosylations Fournit la localisation de la modification post-traductionnelle Seul spectromètre de masse utilisant ce mode de scan Mode de scan utilisé aussi pour le diagnostic clinique 25 mai

53 Bilan technique du «plateau» 25 mai

54 Mise au point extraction protéique Matériel biologique référens : C2C12 à 6 jours de différenciation Cellules lavées dans tampon sucrose Lyse dans tampon : - Tris 40 mm, Urée 7 M, Thiourée 2 M, Chaps 4%, DTT 200 mm, cocktail inhibiteurs de protéases - sonications faibles Centrifugation g 30 min Purification par précipitation : Kit 2D Clean Up Amersham Culot protéique repris dans Tp de charge (ou réhydratation) Urée 7 M, Thiourée 2 M, Chaps 4%, DTT 65 mm, IPG Buffer 0.5% 0.1% Bleu Bromophenol Dosage protéique 2D Quant et stock échantillon à -80 C 25 mai

55 Mise au point gel 2D Mw 1. COUVERTURE PROTEIQUE 50 µg Extrait Nitrate Ag ph3 ph10 ph4 ph7 2. REVELATION ❶250 µg Extrait protéique Bleu Colloïdal ❶ ❷ ❷50 µg Extrait protéique Nitrate Ag ph3 ph10 ph3 ph10 Myoblastes C2C12 à 6j de différenciation, IEF 24 cm en cup-loading coté anode Vhs/75 µa 1.5 mm 10% SDS-PAGE 24*26 cm 25 mai

56 Mw Cœur bovin Tissus biologiques Cerveau souris 400 µg protéines totales Bleu colloïdal ph 4 ph7 150 mg de tissu broyées dans azote liquide, sonications faibles, centrifugation 2000 rpm : kit 2D clean-up, IPG strip 24 cm cup-loading côté anode, 70KVhs 75µA, 1,5 mm 24*26 cm ph 4 ph7 70 kda : HSP 70 + précurseur albumine 42 kda : Actine 23 kda : chaîne légère myosine ❸ ❷ ❶ 50 µg de protéines totales cœur bovin IPG strip 7 cm cup-loading, 50 µa 20KVhs SDS-PAGE 10*10.5 cm coloration Nitrate Argent 25 mai

57 Des protéines mal focalisées? Effet des acides nucléiques, sels, matériel insoluble sur la focalisation des protéines Mw ❶ ❷ ph3 ph10 ph3 ph10 Bleu Colloïdal Nitrate Argent Extrait total de myoblastes (250 µg ❶ 50 µg ❷ à 6j de différenciation (C2C12) IEF 24 cm en cup-loading coté anode Vhs/75 µa 1.5 mm 10% SDS-PAGE 24*26 cm 25 mai

58 Essai 2D-DIGE (formation Amersham) Comparaison de 3 stades de différenciation de Myoblastes (C2C12) Extrait protéique total + 3 gels colorés bleu pour SM Cy3 Cy5 Cy2 Gel n 1 0ja + 2ja + P Gel n 2 2jb + 6ja + P Gel n 3 6jb + 0jb + P Gel n 4 0jc + 2jc + P Gel n 5 6jc + 0jc + P 150 µg= 0 j Cy3 + 2j Cy5 + ST interne Cy2 150 µg= 2 j Cy3 + 6j Cy5 + ST interne Cy2 25 mai

59 Essai 2D-DIGE (formation Amersham) Comparaison de 3 stades de différenciation de Myoblastes (C2C12) Extrait protéique total + 3 gels colorés bleu pour SM Cy3 Cy5 Cy2 Gel n 1 0ja + 2ja + P Gel n 2 2jb + 6ja + P Gel n 3 6jb + 0jb + P Gel n 4 0jc + 2jc + P Gel n 5 6jc + 0jc + P 168 spots variants à 0 jour par rapport à 2 et 6 jours 150 µg= 0 j Cy3 + 2j Cy5 + ST interne Cy2 150 µg= 2 j Cy3 + 6j Cy5 + ST interne Cy2 25 mai

60 Coût consommables gels 2D Extraction classique (sans fractionnement) produits chimiques + consommables + dosage protéique prix/gel HT 25,00 1 gel 2D IEF + équilibration + SDS-PAGE 24*26 cm 10*10,5 cm 22,00 9,10 Révélation - Coloration 24*26 cm Bleu Coomassie colloïdal Nitrate argent 6,50 15,50 10*10,5 cm Bleu Coomassie colloïdal Nitrate argent 3,95 7,30 24*26 cm Marquage cyanines 2D-DIGE 170,00 25 mai

61 Détermination de la sensibilité du spectromètre de masse BSA Coloration au bleu colloïdal 500 ng 75 ng 10 ng 1 ng 1µg 100 ng 50 ng 5 ng Coloration au nitrate d argent (compatible MS) 500 ng 75 ng 10 ng 1 ng 1µg 100 ng 50 ng 5 ng ng 5 ng 25 mai

62 Détermination de la sensibilité du spectromètre de masse Gel de BSA coloré au bleu colloïdal 500 ng 75 ng 10 ng 1 ng 1µg 100 ng 50 ng 5 ng Analyse par nano-lc MS/MS Identification avec un score correct de la BSA 500 ng et 1 µg Sensibilité entre 100 et 500 ng Affiner les résultats en testant des valeurs de BSA entre 100 et 500 ng Répéter cette analyse sur le gel coloré au nitrate d argent 25 mai

63 Vérification de la présence de la protéine ST3GalV Localisation précise de la bande à exciser F4 F3 F2 F1 F1 F2 F3 F4 Analyse par nano-lc MS/MS Protéine Lactosylceramide alpha-2,3- sialyltransferase (souris) Score (pro ID) Protéine validée si score > 1,3 25 mai Nombre de peptides séquencés 4

64 Merci de votre attention les Miquettes! 25 mai