Anticorps anti-cytoplasme des neutrophiles (ANCA) : changement de. Isabelle Graf Pisler

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Victoire Audet
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1 Anticorps anti-cytoplasme des neutrophiles (ANCA) : changement de méthode ELISA->Chemiluminescence Isabelle Graf Pisler

2 Introduction Description de l automate Bioflash Comparaison ELISA vs CLIA Conclusion

3 Dépistage des ANCA Le dépistage se fait par immunofluorescence sur neutrophiles humains fixés à l éthanol. On peut observer 2 aspects: Fluorescence cytoplasmique : c-anca diffuse granulaire fine Fluorescence périnucléaire : p-anca condensé autour du noyau homogène

4 Aspect p-anca : artéfact de fixation à l éthanol éthanol permet migration vers le noyau chargé de protéines chargées + formaldéhyde prévient ce déplacement (aspect c-anca) Hoffman G. S. et. al. Arthritis and Rheumatism 1998

5 Stratégie de dépistage En présence d aspects c ou p une recherche de la spécificité anti-pr3 et anti- MPO est systématiquement réalisée. En cas de demande urgente la recherche d anticorps anti-pr3 et d anti-mpo est directement effectuée. Ce sont des analyses qui doivent être disponibles tous les jours. Le nombre d échantillons testés en même temps est petit. La technique Elisa utilisée auparavant n était pas adaptée à ces conditions.

6 Désavantages de la technique ELISA Analyse par série uniquement. 2 contrôles négatifs, 1 contrôle positif,2 calibrateurs et 1 contrôle interne doivent être utilisés par série Automatisé sur l appareil DSX.Système ouvert permettant d adapter des coffrets de différentes marques. Nécessite le transfert des réactifs dans des flacons calibrés pour le DSX. Source d erreurs potentielles. Résultats après 2 h-2h30. Sensibilité moins bonne que l immunofluorescence : quelques cas positifs en IFI sont négatifs en ELISA avec clinique significative.

7 BIO-FLASH Rapid response chemiluminescent Analyser

8 30 échantillons peuvent être chargés en même temps, le premier résultat est obtenu après 30 minutes puis toutes les minutes. Le chargement peut se faire en continu. Il offre la possibilité théorique de livrer 450 résultats en 8 h. 20 cartouches réactifs peuvent être stockées à bord dans une unité réfrigérée.

9 Avantages : premiers marqueurs d autoimmunité développés : anti-gbm, anti-pr3,anti-mpo Rapidité des résultats (30 minutes contre 2h30 pour le DSX) Chargement en continu (par série sur le DSX) Meilleures stabilités des réactifs Meilleure sensibilité Qualité (moins de risques d erreurs de manipulations liés au transfert de nombreux réactifs) Désavantages : Système fermé (on est lié au fournisseur de réactifs) Paramètres manquants Réactifs ouverts stable au maximum 70 jours Taille des cartouches 50 ou 100 tests.

10 Main Reaction Components

11 Comparaison ELISA -CLIA Rétrospectif Anti-PR3 Anti-MPO ELISA ELISA négatif positif négatif positif CLIA négatif positif CLIA négatif positif

12 Résultats divergents PR3 pour les 2 méthodes la valeur seuil est à 20 LID CLIA ( CU) ELISA (U) IFI (<1/20) Remarques IA négatif 30 positif c-anca 1/40 Pas d'argument IA positif 17 négatif c-anca 1/640 Patiente connue PR3 pos en 2006 et à nouveau pos 2 mois après. IA positif 19 négatif c-anca 1/320 Wegener IA positif 9 négatif c-anca 1/320 suivi Wegener IA positif 12 négatif c-anca 1/320 suivi Wegener IA positif 19 négatif c-anca 1/80 suivi Wegener IA positif 15 négatif c-anca 1/80 Adénome du colon IA positif MPO positif à négatif c-anca 1/40 Maladie à IgG4 IA positif 3 négatif p-anca 1/40 Susp. Vasculite 140 CU

13 Résultats divergents MPO pour les 2 méthodes la valeur seuil est à 20 LID CLIA ( CU) ELISA (U) IFI (<1/20) Remarques IA positif PR3 positif à négatif c-anca 1/40 Maladie à IgG4 IA positif 18 négatif p-anca 1/320 PR,vasculite IA positif 18 négatif p-anca 1/160 LLC,vasculite IA positif 15 négatif p-anca 1/160? pas d'autre prélèvement IA positif 5 négatif p-anca 1/80 PR séronégative Pas d argument IA positif 10 négatif p-anca 1/80 Wegener cancer pulmonaire

14 Comparaison prospective de février à avril 2012 Anti-PR3 Anti-MPO ELISA ELISA négatif positif négatif positif CLIA négatif positif CLIA négatif positif

15 Résultats divergents PR3 pour les 2 méthodes la valeur seuil est à 20 LID CLIA ( CU) ELISA (U) IFI (<1/20) Remarques IA positif MPO positif à positif MPO positif à 38 5 négatif c-anca 1/ négatif MPO positif à 27 C-ANCA 1/40 Maladie à IgG4 cf IA positif 15 négatif p-anca 1 /40?(pas d autre prélèvement) IA positif 14 négatif Pas fait Suivi IA positif 8 négatif Pas fait Suivi Wegener IA positif 15 négatif Pas fait Suivi Wegener positif 6 négatif Pas fait Suivi Wegener

16 Résultats divergents MPO pour les 2 méthodes la valeur seuil est à 20 LID CLIA ( CU) ELISA (U) IFI (<1/20) Remarques IA positif PR3 positif à 32 IA PR3 positif à négatif c-anca 1/2560? 3 PR3 positif à 100 c-anca 1/160 CQ externe IA p-anca 1/320 Pas d autre prélèvement Demande externe IA p-anca 1/80 Résultat à 9 CU et 1/40 3 mois après. Demande externe IA Negatif sur formol Pas d argument IA Negatif sur formol

17 Valeur CLIA PR3 (n=72 prospectif) Valeur ELISA y = x R² =

18 Anti-PR3 ( Patient AM1948) ELISA CLIA IFI

19 Anti-PR3 (patient LBS 1945 ) 200 Suivi du au ELISA CLIA

20 conclusion Test plus dynamique Résultats plus élevés ne veut pas dire activité pathologique plus forte Pas de faux négatif Meilleure confirmation de l IFI Valeur seuil à 20?

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