LES ACIDES NUCLEIQUES

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1 LES ACIDES UCLEIQUES lan du cours I - ITRDUCTI II - ISTRIQUE III - LCALISATI III - A - AD III - B - AR IV - STRUCTURE RIMAIRE IV - A - Les bases IV - B - Les sucres = les oses IV - C - Les nucléosides IV - D - Les nucléotides IV - E - omenclature IV - F - Assemblage des nucléotides V - STRUCTURE SECDAIRE V - A - L AD (Modèle Watson et Crick) V - B - L AR VII - SYTÈSE DE L'AD : L'AD polymérase de Kornberg VIII - RRIÉTÉS YSIC-CIMIQUES VIII - A - Acides forts, VIII - B - Absorption de la lumière UV à 260 nm VIII - C - Dénaturation par perte de la structure secondaire IX - MÉTDES D'ÉTUDES YSIQUES IX - A - Gradient de saccharose IX - B - Gradient de chlorure de césium IX - C - Electrophorèse en gel d agarose IX - D - Réaction avec le Bromure d'éthidium X - TECIQUES D'AALYSE DES ACIDES UCLÉIQUES X - A - ydrolyse totale acide X - B - ydrolyse basique : différence entre AD et AR X - C - ydrolyses enzymatiques : endonucléases, exonucléases, enzymes de restriction VI - STRUCTURE TERTIAIRE VI - A - L AD VI - B - L AR XI - DÉTERMIATI DE LA SÉQUECE DE L'AD Méthode de Sanger 1 Structure rimaire I - Les bases hétérocycliques 2 types de noyaux C C C 3 2 C C 4 5 C 6 C 1 purine pyrimidine 2 1

2 Structure rimaire I - Les bases hétérocycliques Bases puriques Guanine Adénine 3 Structure rimaire I - Les bases hétérocycliques Bases pyrimidiques C 3 Cytosine Uracile Thymine 4 2

3 Structure rimaire Formes tautomères des bases 5 Structure rimaire II - Désoxynucléosides C D-2-Désoxyribose 2 C C Liaison β--glycosidique 2 C Désoxycytidine Désoxythymidine 6 3

4 Structure rimaire II - Désoxynucléosides C D-2-Désoxyribose 9 2 C 2 1 Désoxyguanosine 2 9 Liaison β--glycosidique C 2 1 Désoxyadénosine 7 II - ucléosides Structure rimaire C D-2-Ribose C 2 C 2 Liaison β--glycosidique 1 1 Cytidine Uridine 8 4

5 II - ucléosides Structure rimaire C D-2-Ribose 9 2 C 2 1 Guanosine C Adénosine Liaison β--glycosidique 9 III ucléotides : Structure rimaire ucléosides mono-phosphate Liaison ester C (5') 2 (3') Base purique ou pyrimidique Liaison ester C (5') 2 (3') Base purique ou pyrimidique 10 5

6 III ucléotides : Structure rimaire nucléosides mono-phosphate Désoxycytidine-5 -monophosphate Uridine-2 -monophosphate Adénosine-2 --monophosphate cyclique 11 Structure rimaire III ucléotides : 2 Adénosine-5 -monophosphate (AM) α 5 C Liaison anhydride 9 Liaison anhydride 9 β α 5 C γ β α 5 C Adénosine-5 -diphosphate (AD) Adénosine-5 -triphosphate (AT) 12 6

7 Structure rimaire MECLATURE DES BASES, DES UCLESIDES ET DES UCLETIDES BASE SUCRE UCLESIDE (pentose + base) UCLETIDE (nucléoside-5 -phosphate) Adénine (A) Ribose Désoxyribose Adénosine Désoxyadénosine Adénosine-5 -monophosphate (AM) Désoxyadénosine-5 -monophosphate (dam) Guanine (G) Ribose Désoxyribose Guanosine Désoxyguanosine Guanosine-5 -monophosphate (GM) Désoxyguanosine-5 -monophosphate (dgm) Cytosine (C) Ribose Désoxyribose Cytidine Désoxycytidine Cytidine-5 -monophosphate (CM) Désoxycytidine-5 -monophosphate (dcm) Uracile (U) Ribose Uridine Uridine-5 -monophosphate (UM) Thymine (T) Désoxyribose Désoxythymidine Désoxythymidine-5 -monophosphate (dtm) 13 Structure rimaire IV - La liaison phosphodiester C (5') 2 Base purique ou pyrimidique (3') A 3' C 3' G 3' Liaison 3',5'-phosphodiester Base purique Extrémité 5 Extrémité C (5') 2 ou pyrimidique 5' 5' 5' (3') 14 7

8 Structure rimaire V - Les acides nucléiques = polymères de nucléotides 2 2 A 2 A 2 C (5') 2 C C 2 (5') C C 2 G 2 C 2 G 2 C 2 C 3 T C 2 U C 2 (3') C 2 (3') brin d'ad brin d'ar 15 5 Structure Secondaire La double hélice de Watson-Crick Bases 5 ses hosphates Représentation schématique de l AD 5 5 Modèle éclaté de l AD en double hélice Vue du dessus d un brin d AD de la double hélice 16 8

9 Structure Secondaire La double hélice de Watson-Crick 3,4 Å 5 Thymine (T) 34 Å 10 paires de bases Adénine (A) Cytosine (C) Guanine (G) Désoxyribose (sucre) hosphate Liaison ydrogène 5 20 Å 17 Les paires de bases Structure Secondaire - - C 2 C G C 2 paire G = C - - C 3 A C 2 T C 2 paire A = T 18 9

10 Structure Secondaire Formes de l AD etit sillon Grand sillon Grand sillon etit sillon AD-A AD-B AD-Z as de différence de taille entre grand et petit sillon. Grand sillon très profond, petit sillon très peu profond. Différence de taille entre grand et petit sillon. etit sillon profond. 19 Structure Secondaire AD-B Aspect des sillons Configuration spatiale de la paire de bases 20 10

11 Structure Secondaire lissement des oses AD-B AD-A 21 Structure Secondaire CFIGURATI ATI ET SY DES UCLÉSIDES Adénosine configuration anti Adénosine configuration syn 22 11

12 Structure Secondaire Commune aux molécules d AR de transfert Extrémité 5 phosphorylée Site d attachement de l acide aminé Boucle DU Boucle Tψ C Bras supplémentaire (Variable) ARt hénylalanine Boucle Anticodon 23 Structure Tertiaire AD génomique des Cellules eucaryotes istones 1 CRMATIE SUS FRME DE FIBRE DE 30 M ucléosome 24 12

13 Structure Tertiaire AD circulaire Forme relâchée Mitochondries Chromosome bactérien lasmides Choloroplastes Forme superenroulée 25 Structure Tertiaire Commune aux molécules d AR de transfert Site d attachement de l acide aminé Boucle Anticodon 26 13

14 27 Dénaturation de l AD Thermodénaturation de l AD : effet hyperchrome Absorbance relative à 260 nm 0% AD simple brin Domaine de transition T M 100% AD simple brin yperchromicité en pourcentage ( C) 28 14

15 Ultracentrifugation en gradient de saccharose Séparation des macromolécules en fonction de leur vitesse de sédimentation 28 S 18 S AR ribosomiques 5 S AR de transfert 29 Ultracentrifugation en gradient de chlorure de césium Séparation des macromolécules en fonction de leur densité de flottaison Macromolécules Solution de Chlorure de Cesium 6M Ultracentrifugation : établissement d un gradient continu de densité. Macromolécules à faible densité de flottaison Macromolécules à forte densité de flottaison 30 15

16 Electrophorèse en gel d agarose aut du gel Taille AD (paires de bases) 6000 Sens de migration ETIDIUM Bas du gel Détermination de la taille des acides nucléiques Cathode aires de bases (pb) oids moléculaire (échelle logarithmique) Anode 1 : Fragments AD de tailles connues 2 : Fragment AD de taille inconnue Migration en mm 32 16

17 ydrolyse alcaline : différence entre AR et AD AR : présence de 2 -, sensible à l hydrolyse alcaline ( - ) AD : absence de 2 -, résistant à l hydrolyse alcaline ( - ) 33 ydrolyse enzymatique : endonucléases, exonucléases (exemples) EZYME TYE SUBSTRAT RDUITS ADase I Endonucléase AD (mono- ou bicaténaire) olynucléotides à extrémités 5 -p ARase A (pancréas de bœuf) Endonucléase -XpUp + YpZ- -XpCp + YpZ- -XpUpYpZ- -XpCpYpZ- Ribonucléase T1 Endonucléase (et exonucléase) -XpGp + YpZ- -XpGpYpZ- Ribonucléase U2 hosphatase alcaline hosphodiestérase de rate Endonucléase (et exonucléase) Exonucléase Exonucléase -XpGp + YpZ- -XpAp + YpZ- -XpGpYpZ- -XpApYpZ- -YpZp pxpy- Xp + YpZ- XpYpZ- -YpZ + i XpY- + i hosphodiestérase de venin de serpent Exonucléase -XpYpZ -XpY + pz 34 17

18 Les enzymes de restriction Eco RI 5'GAATTC3' engendre des extrémités 3'CTTAAG5' 5 protubérantes 5'...G3' 5'AATTC...3' 3'...CTTAA5' 3'G...5' ae III 5'GGCC3' engendre des extrémités 3'CCGG5' franches 5'...GG3' 3'...CC5' 5 CC...3' 3 GG...5' st I 5'CTGCAG3 engendre des extrémités 3'GACGTC5' protubérantes 5'...CTGCA3' 5 G...3' 3'...G5' 3 ACGTC...5' 35 Séquençage de l AD par la technique de Sanger (1) 5' C A T G G C A C A A 3' AD monocaténaire de séquence inconnue 32 T G T T Amorce marquée radioactivement Réaction de polymérisation avec interruption aléatoire par incorporation d un ddt. Les ddt, n ayant pas de groupement en, ne peuvent pas servir d accepteur de la liaison phosphodiester. L élongation de la chaîne est interrompue par leur incorporation. AD polymérase I dat dgt dct dtt + ddt (didésoxynucléotide) ddat ddct ddtt ddgt 36 18

19 Séquençage de l AD par la technique de Sanger (2) Electrophorèse sur gel Détection des bandes radioactives (par autoradiographie) Sens de migration ddat + ddct + ddtt + ddgt Séquence lue sur l autoradiographie (compémentaire du brin initial) G T A C C G T G T T

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