Screening toxicologique haute résolution dans le sang par mesure de la masse exacte (Q Exactive )
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- Valérie Bernard
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1 Screening toxicologique haute résolution dans le sang par mesure de la masse exacte (Q Exactive ) - Thomas GICQUEL CHU Rennes UMR 991 INSERM -Université de Rennes I
2 Introduction Screening toxicologique : nécessite l identification d un nombre illimité de composés dans des matrices souvent complexes. Dans certains cas de manière rétrospective pour l identification de nouvelles substances. Screening dans des échantillons de sang total : - Par mesure de la masse exacte : couplage d un quadrupole à la technologie OrbiTrap (Q Exactive, Thermo) - Comparaison aux résultats de screening par - HPLC-DAD - LC-MS/MS
3 Matériel et méthodes Préparation des échantillons 500µL de sang EI = Flurazepam Extraction par Toxitube A (Varian) Evaporé, repris par 500 µl d eau Injection dans LC/MS (Q Exactive) Chromatographie liquide Phase Mobile = gradient : Acetate d ammonium (10 mm) + 0.1% Acide Formique Acetonitrile + 0.1% Acide Formique Colonne : Gold PFP column (150x2.1mm 3µm). Chromatographie de 32 minutes
4 Gradient A : Acetate d ammonium (10 mm) + 0.1% Acide Formique B : Acetonitrile + 0.1% Acide Formique
5 Spectrométrie de masse Mesure de la masse exacte (à 5 ppm) ESI Q-Exactive High Resolution Accurate Mass Instrument.
6 Spectrométrie de masse Source ionisation = Heated Electrospray Source Ionization (HESI) Ionisation positive / négative alternativement Selection des ions parents (entre 150 et 800 m/z) Fragmentation des ions les plus abondants à une énergie de collision de 70% (NCE) 3 MS² en négatif 8 MS² en positif Resolution : 70,000 FWHM en mode full scan 17,500 FWHM en mode MS²
7 Analyse des données Résultats Les données ont été analysées avec le logiciel ExactFinder 2.0 Les composés ont été identifiés grace à : Leur temps de rétention (RT) Leur masse exacte (à 5 ppm) Leurs fragments Confirmation grâce au massif isotopique (+1 m/z) Comparaison à une banque de données contenant 650 molécules Cercle vert : Composé identifié et confirmé Triangle jaune : Composé identifié mais non confirmé Carré rouge : Composé non identifié
8 Résultats sur ExactFinder Identification de Diazepam : RT + Masse exacte
9 Résultats sur ExactFinder Fragment de confirmation du Diazepam : Bibliothèque Detecté
10 Identification des metabolites En mode Full scan : Identification des metabolites grace à leurs masses exactes (m/z) EDDP EMDP Methadone Retrouve la méthadone et ses métabolites
11 Application : Analytes identifiés dans 39 échantillons sanguins différents selon 3 méthodes :
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13 Comparaison des 3 technologies Meilleure identification par le Q Exactive Identification de : 143 composés par masse exacte 121 composés grace à 6 techniques différentes de LC-MS/MS 69 composés par barette de diode (DAD) Barette de diodes Quelques faux positifs et faible sensibilité pour BZD LC-MS/MS Bonne identification mais necessite 6 méthodes donc 6 injections différentes Pas d analyses retrospectives possible
14 Masse exacte - Q-Exactive - Identification par masse exacte - Comparaison à une grande bibliothèque (650 molécules) - Analyse retrospective possible Limites de cette approche : L ion majoritaire (précurseur) est fragmenté : si intensité faible : pas forcément trouvé en MS² Les isomères (ex: maprotiline, paroxetine et EDDP) ont exactement la meme masse exacte : necessite d avoir des fragments et temps de rétention différents Logiciel ExactFinder 2.0 : masse exacte fixée à 5 ppm entre 150 et 800 (m/z) Les petits fragments (ex: paracétamol : 110,0595) ne seront pas identifiés
15 Conclusion Cette approche de screening par masse exacte (Q Exactive) identifie plus de composés que la LC-DAD ou la SRM. L identification des métabolites peut etre réalisée grace à leur m/z théorique Cette méthode permet une analyse retrospective Librairies en ligne afin d étendre la base de données
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17 FIGURE 4. Source Parameters for HESI Probe. Parameter Value Sheath Gas 30 Aux gas 15 Spray voltage (V) 3500 Capillary temp ( C) 320 Vaporizer Temp 350
18 Parameter FIGURE 3. Scan Parameters for Q-Exactive Mass Spectrometer Full MS Value Microscans 1 Resolution (FWHM) 70,000 AGC Target 1e6 Maximum IT 250 msec Scan Range m/z MS 2 Experiments Microscans 1 Resolution 17,500 AGC Target 1e5 Maximum IT 250 msec NCE 70.0
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