Université de La Réunion. Centre Hospitalo-universitaire de La Réunion

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1 Université de La Réunion Centre Hospitalo-universitaire de La Réunion Mémoire du diplôme d'universitaire d addictologie Océan Indien Mémo des examens de biologie médicale à l'usage d'addictologue Noor Hamdani Décembre 2012

2 Table des matières Introduction...2 Abréviations...3 Méthodes analytiques...4 Les réactions colorées...4 La spectroscopie visible et ultraviolette...4 Les tests immunologiques...5 Chromatographie en phase gazeuse...10 Chromatographie liquide haute performances...11 Spectroscopie d'absorption et d'émission atomique...13 Substances chimiques...14 Alcool éthylique...14 Nicotine...18 Médicaments psychotropes...20 Opiacés...24 Cocaïne...27 Cannabinoïdes...28 Amphétamines...29 Conclusion et perspective...31 Bibliographie...32 Page 1

3 Introduction Au cours de l'exercice de ma profession comme biologiste au laboratoire de biologie médicale, je suis souvent amené en concertation avec les collègues d'autres spécialités à poser une indication d'examens de biologie. Il m'arrive aussi de recadrer la demande d'examens de toxicologie dans son contexte clinique. Pendant ma formation au diplôme d'addictologie, l'idée est apparue de consolider ce lien de dialogue entre les cliniciens et le biologiste par la rédaction d'un mémo qui, espérons-le, aidera les addictologues et les collègues d'autres spécialités dans l'expression de leur demande d'analyses en biologie. Ce mémo viendra en complément (et sur la base) d'un dialogue préexistant et en aucun cas ne pourra se prétendre comme remplaçant celui-ci. La toxicologie reste néanmoins une science multidisciplinaire où tous les partenaire doivent travailler en étroite collaboration pour élucider un cas d'intoxication ou pour le suivi thérapeutique des patients. D'autre part, le domaine de la toxicologie est très spécialisée et en évolution constante, évolution due entre autres à l'apparition d' instruments de mesure de plus en plus sophistiqués mais aussi perfectionnés. Grâce aux progrès récents notamment en immunochimie, de nombreux paramètres peuvent aujourd'hui être analysés dans les échantillons biologiques et ce en un temps parfaitement compatible avec les exigences cliniques en terme de prise en charge des patients. Cependant la décision de pratiquer ou non telle ou telle recherche toxicologique doit s'appuyer sur les arguments pertinents, prenant en compte les symptômes cliniques, le contexte et l'histoire de l'intoxication : toxique(s) suspecté(s), voie d'exposition, moment d'exposition, les traitements chroniques, les habitudes toxicomaniaques, l'état clinique du patient, le moment de prélèvement d'échantillon et les traitement reçus avant les prélèvements. Les performances des méthodes analytiques, le niveau de technicité requis et leur coût sont très variables. Et de fait, des demandes d'analyse "tous azimuts" ne modifient que très rarement la prise en charge du patient. Cela implique une parfaite connaissance des performances des tests pratiqués et tout particulièrement en ce qui concerne la sensibilité et la spécificité. Cette connaissance des limites du test fait partie de la coopération indispensable entre les cliniciens et les biologistes. De même, toutes les sources de discordances entre la présentation clinique du patient et le résultats des analyses doivent être investiguées systématiquement : histoire clinique non fiable, toxique sans symptomatologie clinique initiale, intoxication mixte, méthodes analytiques utilisées peu performantes ou inadéquates, type d'échantillon inadapté, intervalle entre l'intoxication et prélèvement trop court ou trop long, etc. L'objectif de cette mémoire est donc de permettre aux cliniciens lorsqu'ils s'orientent à partir d'anamnèse et des symptomatologies qu'ils observent vers une hypothèse d'intoxication et/ou exposition par une (ou des) classe chimique, de demander une investigation biologique pertinente. Il faut le rappeler encore une fois qu'en toxicologie, la prise en charge d'un patient sera toujours un cas particulier et unique bien qu'il soit possible de dégager les éléments généraux de cette prise en charge. Pour cela ce mémo se veut non exhaustif et très simplifié en répertoriant les grande lignes. Nous commencerons par citer les différents méthodes analytiques dans un premier temps. Ensuite viendront les différentes classes chimiques les plus rencontrées en addictologie. Page 2

4 Abréviations BD BZD CEDIA CPG EDTA EIA ELISA EMIT EPI FPIA HPLC KIMS LSD MBDB MDA MDEA MDMA MS RIA SAA UPLC Barrette de photodiodes Les benzodiazépines Clone Enzyme Donor Immuno Assay Chromatographie en phase gazeuse L'acide éthylène diamine tétraacétique Enzyme Immuno Assay Enzyme linked Immuno Sorbent Assay Enzyme Multiplied Immunoassay Technique La spectrométrie d'émission à plasma inductif Fluorescence Polarization Immuno Assay Chromatographie liquide haute performance Kenitic Interaction of Microparticles in Solution Le Diéthylamide de l'acide lysergique 2-méthylamino-1-(3,4-méthylènedioxyphényl)butane 3,4-méthylènedioxyamphétamine ou MDE (3,4-méthylènedioxy-N-éthylamphétamine) ou l'ecstasy (extasy) ou MD (pour 3,4-méthylène-dioxy-N-méthylamphétamine) Spectroscope de masse Radio Immuno Assay Spectrométrie d'absorption atomique Chromatographie liquide ultra performance Page 3

5 Première partie Méthodes analytiques Les techniques d'analyses en biologie médicale ont considérablement évolué ces dernières décennies obligeant le biologiste à être un technicien de haut niveau. La complexité des matrices biologiques (sang, urines, cheveux, etc.) justifie une utilisation des méthodes de plus en plus performantes. Ce chapitre aborde successivement les réactions colorées, aujourd'hui désuètes, la spectroscopie visible et ultraviolette, les immunodosages, les méthodes séparatives telles la chromatographie en phase gazeuse, la chromatographie liquide haute performance (HPLC) et enfin les spectrométrie d'absorption et d'émission atomique. Les réactions colorées Beaucoup de substances produisent une réaction colorée lorsqu'elles rentrent en contact avec les réactifs. Ces réactions colorées bien que caractéristiques sont rarement spécifiques à la substance recherchée. Les résultats de ces réactions peuvent être améliorés lorsque le milieu à analyser est soumis préalablement à des purifications par exemple une séparation chromatographique sur couche mince. Cependant, aujourd'hui les réactions colorées doivent être abandonnées au profit des méthodes plus spécifiques et aussi plus sensibles. La spectroscopie visible et ultraviolette La spectroscopie d'absorption dans les régions ultraviolette (UV) et visible est connu de longue date et a été largement utilisée en analyse biomédicale dans un but quantitatif et qualitatif. C'est dans cet esprit qu'avant l'avènement des méthodes immunologiques en toxicologie hospitalière, la caractérisation de certaines familles thérapeutiques était réalisée en traçant le spectre d'absorption UV d'un extrait d'un échantillon biologique. Page 4

6 L'identification de famille telles que les barbituriques par l'acquisition directe d'un spectre UV d'un extrait est désormais obsolète. En revanche cette technique est utilisée lorsqu'elle permet la détection et l'identification des molécules préalablement isolées par un système séparatif en phase liquide, par exemple. D'autre part, la quantification par cette technique utilise l'absorption moléculaire à des longueurs d'onde données, soit sur des molécules isolée, soit sur des molécules mises en valeur par leur réactivité chimique avec un réactif chimique. Apparaît alors une réaction colorée spécifique d'une molécule ou d'un groupe de molécules dont le dosage est obtenue par la mesure d'absorption dans le spectre visible. A titre d'exemple, le dosage des ions cyanures dans le sang est encore à l'heure actuelle couramment et facilement obtenu par une telle approche. Il y a pas si longtemps c'était le cas pour les salicylés avant l'apparition des tests immunologiques. En effet, les salicylés réagissent au réactif de Trinder, l'intensité de la coloration peut ensuit être mesurée versus une gamme d'étalonnage. Une dernière application de cette technique toujours très utilisée concerne la détermination des fractions de l'hémoglobine : oxyhémoglobine, carboxyhémoglobine, méthémoglobine par des lectures à différentes longueurs d'onde d'un échantillon sanguin. Des appareils automatisés existent pour de tels dosages. Dans la partie suivante nous allons voir que la lecture d'une absorbance dans l'uv est aussi utilisée afin de caractériser la présence de molécules dont la mise en valeur a été obtenue, non pas par une réactivité chimique directe, mais par intermédiaire d'un complexe antigène-anticorps qui provoque une réaction enzymatique : c'est le principe d'immunochimie. Les tests immunologiques Les tests immunologiques (ou la méthode immunoanalyse) ont pris une place prépondérante en analyse de routine des échantillons biologiques. Utilisés par les laboratoires hospitaliers ou non, les méthodes vont d'un simple test unitaire à l'utilisation des automates à haut débit. Leur popularité a été assurée par un meilleure sensibilité, l'automatisation et par la possibilité de traiter les échantillons sans phase préliminaire d'extraction-séparation. Les tests immunologiques sont fondés sur la réaction d'un anticorps spécifique de la molécule ou la famille à doser, d'un antigène (molécule ou la famille chimique : médicament, stupéfiant) et une forme marquée de ce même analyte. On utilise une réaction de compétition en plaçant dans un environnement fermé une fraction connue d'anticorps, de la molécule marquée et une fraction inconnue de la molécule à analyser d'un échantillon biologique. On induit ainsi la formation de deux complexes antigènes-anticorps, l'un avec la molécule marquée, l'autre avec la molécule à doser, qui vont rentrer en compétition. De ce fait, la proportion de la molécule marquée fixée à l'anticorps est inversement proportionnelle au nombre de molécules non marquées initialement présentes dans l'échantillon à doser. La production d'anticorps plus ou moins spécifique d'une molécule donnée ou d'une famille chimique permet, soit un dosage particulier dans cas par exemple des suivis thérapeutiques, soit un dépistage par famille chimique dans le cas de la recherche systématique en toxicologie. Il existe deux principales technique de quantification de la réaction immunologique. Soit, il n'y a pas de différence entre les signaux mesurés produits par les formes libres et liées à l'anticorps de la molécule marquée. Ainsi la séparation des deux formes est nécessaire avant toute mesure : ce sont les techniques en phase hétérogène. À l'inverse, lorsque la molécule marquée est une enzyme ou un fluorophore, la mesure est Page 5

7 réalisée par un changement optique généré par une différence de comportement entre la forme liée et la forme libre. Il n'est pas nécessaire de séparer les formes : ce sont les dosages en phase homogène, moins sensibles, mais plus simples et totalement automatisables. La voie de l'immunoanalyse a été ouverte d'abord selon les techniques hétérogènes par Yalow et Berson qui mirent au point en 1959 le dosage de l insuline par Radio Immuno Assay (RIA). En 1970, Spector et Parker produisirent des anticorps anti-morphine, ce qui permit son dosage par RIA. La production d anticorps spécifiques a été perfectionnée après les travaux de Kohler et Milstein, puis ceux de Chiswell et McCafferty. Les avantages des tests en phase hétérogène ont été exploités pour doser des molécules actives à très faibles concentrations : buprénorphine par RIA, LSD par Enzyme Immuno Assay (EIA). C est la RIA qui a permis à Baumgartner de lancer les recherches de stupéfiants dans les cheveux. L adoption d un marqueur chimiluminescent par la société DPC a permis de gagner en sensibilité par rapport à la RIA. Par la suite, le développement des microplaques a permis l automatisation des dosages par Enzyme linked Immuno Sorbent Assay (ELISA). Parallèlement, les tests en phase homogène se sont développés, principalement dans deux directions : marquage par une enzyme Enzyme Multiplied Immunoassay Technique (EMIT) ou par la fluoresceine Fluorescence Polarization Immuno Assay (FPIA). Utilisant les progrès de la génétique, la technique Clone Enzyme Donor Immuno Assay (CEDIA) a représenté une autre avancée dans ce domaine. La mesure de l'agglutination anticors-antigènes par la méthode Kenitic Interaction of Microparticles in Solution (KIMS) autorise aussi des dosages en grande série. Plus récemment, des progrès novateurs viennent de l utilisation automatisée de biochips et de particules paramagnétiques [1]. Il est bien établi que l immunoanalyse peut servir au dépistage de la présence d une molécule ou d'une famille chimique, mais ne peut pas être utilisée comme méthode de confirmation. Cependant des tests peuvent très bien être utilisés pour doser directement des molécules bien définies (suivis thérapeutique des médicaments). La sensibilité du test doit être en adéquation avec la concentration attendue dans la matrice étudiée et ici entrent en jeux les réactions croisées avec d autres molécules de la même famille. La spécificité doit être telle que l on n obtienne pas ou peu de résultats faux positifs. Enfin, le test doit être répétable. Il ne fait aucun doute que tous les tests commercialisés actuellement pour détecter des familles et/ou pour doser des xénobiotiques précis remplissent parfaitement ces critères. Dans le cadre de suivi thérapeutique, des kits prêts à l'emploi existe pour nombreuses molécules : acide salicylique, acide valproïque, carbamazépine, imipramine, paracétamol, phénobarbital et phétoïne. Ces trousse peuvent être dédiées à la toxicologie sous réserve de dilution adéquate de l'échantillon. En regard de la consommation des produits stupéfiants, il existe aussi quelques trousses sur les molécules telles que : l'alcool éthylique, la buprénorphine, le dextropropoxyphène, la méthadone et la phencyclidine. Enfin, il existe des kits autorisant une recherche sur une famille chimique : les amphétamines, les antidépresseurs tricycliques, les barbituriques, les benzodiazépines, les cannabinoïdes, la benzoylecgonine (métabolite principal stable de la cocaïne) et les opiacés. S'attachant à la recherche systématique et utilisant des anticorps dont le taux de croisement est le plus important possible sur les composés du groupe chimique à tester, les kits ont une spécificité moins bonne que dans le cas des molécules isolées. Il convient donc d'être extrêmement vigilant quant à la survenu des faux positifs. En d'autre terme, un résultat positif est une présomption jusqu'à ce qu'il soit confirmé par une technique séparative. Page 6

8 Il arrive aussi que certaines molécules qui ont une activité pharmacologique proche ne soient pas reconnues car possédant une structure moléculaire distincte de la famille chimique recherchée. Au sein d'une famille chimique homogène sur le plan structure chimique, les molécules dont le pourcentage de réaction croisée est inférieur à celui de la molécule de référence pour la famille, ne sont détectable qu'à des concentrations très élevées et souvent dans la zone toxique. Il convient donc également de rester critique vis-à-vis d'un résultat négatif. Dans tous les cas il faut s'assurer de la pertinence des moyens de recherche mis en œuvre à l'investigation biologique comme examen complémentaire. Le tableaux 1 résume les différentes molécules détectées à taux thérapeutiques ou toxiques, les molécules d'activité proche non détectables et les risques de faux positifs pour les principaux kits de recherche en toxicologie par la technique d'immunodosage à polarisation de fluorescence [2]. La places des bandelettes urinaires Dans le domaine de la sécurité routière, la possibilité de pouvoir dépister chez les conducteurs la présence de stupéfiants dans les urines ou la salive «au bord de la route» est d'un intérêt indiscutable. Il va de même dans certain cas dans le domaine de l'addiction aux substances illicites en milieu professionnel, chez les personnels naviguant par exemple. Certains auteurs ont aussi proposé d'organiser ces dépistages dans les centres de prise en charge en addictologie [3]. L'intérêt est certain à condition que cela soit réalisé dans le cadre d'un partenariat avec un laboratoire de toxicologie, qui puisse valider les résultats et résoudre les litiges par l'utilisation des méthodes séparatives chromatographiques. En plus des drogues, de nombreux fabricants proposent aujourd'hui des tests permettant dépister simultanément une dizaine de substances, dont les médicaments (paracétamol, salicylés, etc.). Cette présentation pourrait alors séduire les «urgentistes» par la possibilité de faire une «toxicologie au lit du malade». Compte tenu des problèmes de fiabilité mentionnés précédemment, et lorsque l'établissement hospitalier dispose d'un laboratoire pouvant réaliser des analyses toxicologiques, cette démarche ne serait aucunement pertinente. En revanche, lorsqu'il n'y a pas de laboratoire à proximité de rendre un résultat en urgence, cette toxicologie délocalisée peut être envisagée, et là encore à condition qu'il ait une collaboration avec un laboratoire de toxicologie du département ou de la région [4]. Page 7

9 Test Molécules reconnues à taux thérapeutiques Molécules reconnues à taux toxiques Faux positifs Molécules non reconnues Alcool éthylique éthanol n-butanol, n-propanol Autres alcools, y compris glycols et l'acétone Cocaïne métabolite benzoylecognine cocaïne, méthylecgonine ester, ecgonine Δ9-Cannabinoïdes Amphétamines Opiacés Δ9-THCCOOH, 11-OH-Δ9-THC, 8-β-11-diOH-Δ9-THC benzphétamine, chlorphentermine, cyclopentamine, d,l-amphétamine, d,l-éphédrine, d,l-métamphétamine, phénylpropanolamine, propylhexédrine 6-acétylmorphine, codéine, dihydrocodéine, dihydromorphine, éthylmorphine, héroïne, hydrocodone, hydromorphone 8-β-OH-Δ9-THC, cannabinol aminopropylphénone, diéthylpropion, fencamfamine, fenfluramine, isométheptène, MBDB, MDA, MDEA, MDMA, méphentermine, N-méthyléphédrine, nylidrine morphine-3-β-dglucuronide, levallorphane, levorphanol, norcodéine, normorphine, noroxymorphone, pholcodine, thébaïne hydroxyamphétamine, phenmétrazine, pseudoéphérine, amantadine, benzathine, dobutamine, halopéridol, labétalol, trazodone, tryptamine, tyramine. Outres ces peroduits, de très nombreuses amines de putréfaction alphaprodine, cyclazocine, flurazépam, mépéridine, nalorphine, naloxone, naltrexone, tripolidine cannabidiol alfentanyl, apomorphine, buprénorphine, dextromoramide, EDDP, fentanyl, lévoalphaacétylmorphine, méthadone, noscapine, papavérine, phénopéridine, propoxyphène, sulfantanyl Page 8

10 Test Molécules reconnues à taux thérapeutiques Molécules reconnues à taux toxiques Faux positifs Barbituriques Tous les barbituriques Fenoprofène, gluthéthimide, ibuprofène, naproxène, phénytoïne, primidone Antidépresseurs tricycliques Benzodiazépines Tableau 1 amitryptiline, clomipramine, désipramine, doxépine, imipramine, norclomipramine, nordoxépine, nortriptyline, protriptyline, trimipramine benzophénone, bromazépam, chlorazépate, chlordiazépoxide, clonazépam, déalkylprazépam, diazépam, flurazépam, kétazolam, lorazépam, médazépam, midazolam, nitrazépam, nordazépam, oxazépam, pinazépam, témazépam, tofisopam Amoxapine, loxapine, maprotyline, miansérine alprazolam, bromazépam, déalkylflurazépam, estazolam, flunitranzépam, triazolam Carbamazépine, chlorpromazine, cyclobenzapride, cyproheptadine, diazépam, diphénydramine acide flufénamique, acide méfénamique, fluoxétine, indométhacine Molécules non reconnues molécules non barbituriques mais d'activité proche non reconnues : méthaqualone, carbamate IMAO : toloxatone, iproniazide, moclobémide benzamide : amisulpride, sulpiride, sultopride, tiapride dibenzodiazépine : clozapine thioxanthènes : zuclopenthixol sérotoninergique : fluoxétine, fluvoxamine, citalopram non imipraminique : tianeptine, amineptine, oxaflozane molécules non benzodiazépines mais d'activité proche non reconnues : buspirone, gépirone, suriclone, zolpédem, zopiclone Page 9

11 Chromatographie en phase gazeuse La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est, comme les autres méthodes chromatographiques, une technique de séparation qui autorise l'analyse d'un mélange et permet d'en individualiser les constituants d'intérêt. L'étape séparative est réalisée sur une colonne contenant une phase stationnaire (liquide ou solide) dont la température est régulée, tandis qu'un flux de gaz vecteur réalise l'élution des composés et les entraîne vers un détecteur. Introduites dans la colonne au moyen d'un injecteur adapté, les molécules se répartissent entre la phase stationnaire et la phase gazeuse. Celles qui ont plus d'affinité pour la phase stationnaire y séjourneront plus longtemps, atteignant ainsi le détecteur plus tardivement. Il en résulte une séparation du mélange selon l'affinité de chaque molécule pour la phase stationnaire et pour la phase gazeuse. Le détecteur produira alors un signal proportionnel à la quantité de masse qui sera passé à travers lui. Chaque produit se trouvera ultérieurement assigné d'un caractéristique chromatographique appelé le temps de rétention (TR) propre d'une phase stationnaire, du produit et des conditions chromatographiques, c'est-à-dire de l environnent dans lequel est réalisé l'acquisition des données. La difficulté principale en CPG, comme nous l'avons compris, c'est l'optimisation de temps de rétention d'un composé d'intérêt. On entend ici par optimisation, l'étape de séparation dans de strictes conditions d'analyse. En effet il conviendrait, pour parler d'optimisation, de : - sélectionner le type de colonne, son diamètre, sa longueur, choisir la nature de phase stationnaire ; - apprécier la nature du gaz vecteur ; - fixer le type d'injecteur, déterminer la température initiale de la colonne et le gradient appliqué et enfin choisir un détecteur adéquat. Au delà des considérations purement analytiques, il est important de s'attarder sur le type de détecteurs utilisés en CPG. Parmi les détecteurs polyvalents, citons le détecteur à ionisation de flamme employé pour le dosage des alcools et des glycols. D'autres détecteur possèdent une sensibilité particulière pour certains atomes. C'est le cas des détecteurs azote-phosphore qui est dédié à l'analyse des alcaloïdes, médicaments et pesticides organo-phosphorés. On trouve ensuite le détecteur à capture d'électrons dont la sensibilité est optimale sur les noyaux aromatique et les halogènes. À ce titre, c'est un détecteur de choix pour les molécules halogénées telles que les benzodiazépines, les pesticides, les solvants halogénés et les gaz anesthésiques. Une place particulière est donnée aux spectromètre de masse (MS) car ce type de détecteur réunit deux avantages considérables : sensibilité et spécificité. Il existe différents appareils, ceux qui travaillent dans l'espace (instruments dits à temps de vol, quadripôles, magnétiques, électriques) et ceux qui travaillent dans le temps (trappe d'ions et appareils à résonance cyclonique). Mais en pratique, les deux types essentiellement présents dans les laboratoires d'analyses médicales sont les trappes d'ions et les filtres quadripolaires. Outre l'analyseur proprement dit (filtre de masse) un détecteur de masse est caractérisé par sa source d'ionisation. Les sources à impact électronique (IE) qui génère une fragmentation ionique importante permet d'établir des banques spectrales de référence pour l'identification des molécules. Viennent ensuite les sources à ionisation chimique (IC) utilisant un gaz réactant qui stabilise la molécule sur son ion moléculaire. On peut alors déterminer précisément la masse molaire d'un produit inconnu. Une autre application possible du détecteur de masse concerne le couplage CPG-MS à rapport isotopique pour lequel on peut théoriquement envisager la comparaison des produits stupéfiants. Les conclusions de certaines études sont cependant discutable car les analyses portent sur des cas isolés à des concentration non représentatives des poudres vendues dans la rue. Des progrès dans ce domaine devraient être envisageable prochainement. Page 10

12 Pour être correctement analysés en CPG, des analytes requièrent deux conditions sine qua non : ils doivent être volatilisables et thermiquement stables. Une procédure de recherche générale des toxiques par CPG doit impérativement être complétée par une technique autorisant l'accès aux autres molécules (chromatographie liquide, électrophorèse capillaire, chromatographie en couche mince, etc.). Afin de compenser cette difficulté à la vaporisation, les produits peuvent être modifiés afin d'abaisser leur point d'ébullition ou d'améliorer leur stabilité thermique. La morphine et la benzoylecgonine, métabolites respectifs de l'héroïne et de la cocaïne, possèdent en effet des comportements chromatographiques très difficiles alors que leurs produits parents sont aisément analysés. Chromatographie liquide haute performances Dans la chromatographie liquide haute performance (HPLC) une phase mobile constituée par un solvant tamponné ou non traverse une colonne contenant la phase stationnaire constituée de billes de failles diamètre (généralement moins de 10 µm, le plus souvent 5 et 3 µm). Le faible diamètre des particules entraîne des pressions en tête de colonne très importantes, entre 50 et 250 bars, nécessitant un système de pompage apte au traitement de telles contraintes. Outre les interactions types adsorption et partage abordées en CPG, la HPLC permet des séparations par échange d'ions, mais aussi d'exclusion et d'affinité. Ce qui augmente considérablement sa capacité d'analyse et ce dans les domaines très vastes. Par exemple, la chromatographie d'exclusion et d'affinité sont réservée aux domaines des polypeptides, les biopolymères, les protéines et les hormones. La chromatographie par échange d'ions permet de séparer les ions (nitrates, nitrites...) mais aussi des homologues mono-, di- ou triphosphorés de nombreuses molécules biologiques. Toutefois, la principale méthode utilisée en toxicologie comme en pharmacologie demeure la chromatographie de partage en phase inverse. L'appellation «phase inverse» signifie que la phase stationnaire est de faible polarité, ce sont souvent des chaînes d'acides gras (de 2 à 18 carbones) greffées sur les microparticules de billes de silice. La phase mobile est une phase polaire hydro-organique c'est-à-dire contenant de l'eau et un modificateur organique (méthanol, acétonitrile, etc.). Ces modificateurs organiques conditionnent le temps de rétention (TR) puisque les médicaments, drogues ou produits toxiques ont une meilleure affinité pour ces solvants que pour de l'eau. La chromatographie en phase inverse couvre donc un large éventail de molécules allant de composés peu polaires à composés assez polaires. Comme en CPG, les critères de sélection de la colonne sont sa logeur, son diamètre, la nature de phase stationnaire et la taille des particules, la température, le débit appliqué et la composition de la phase mobile. Cette dernière est conditionnée par quatre aspects en phase inverse : le ph, la forces éluante, la force ionique et le choix de la sélectivité des solvants dans les interactions analyte/phase stationnaire/phase mobile. Grâce à des taux de greffage plus importante, ces dernières années le progrès techniques a permit de produire des colonnes remplies de particules encore plus fines (allant jusqu'à 1,7 µm). Les phases stationnaires sont plus spécifiques, les surfaces d'échange augmentent, les volumes morte diminuent, les qualités de remplissage s'améliorent, les rendant moins sensibles aux différences et aux à-coup de pression. Par contre, la pression générée en tête de ces colonnes implique des pompes plus performantes produisant des pressions de l'ordre 1000 bars. On parle alors de la chromatographie liquide ultra performance (UPLC). Enfin, il existe tout comme en CPG, des colonnes réalisant une séparation des isomères d'un racémique d'une molécule. Cela est intéressant lorsque une substance vendue sur le marché (licite ou illicite) est un racémique et que les isomères ont chacun une puissance d'action différente. La Page 11

13 méthadone, dont l'isomère lévogyre est environ 50 fois plus actif que la forme dextrogyre. Certains individus métaboliseraient préférentiellement un des deux isomères, présentant ainsi une toxicité de la molécule qui n'est pas obtenue pour tous les patients aux mêmes posologies. En ce qui concerne les détecteurs en HPLC, le plus connu et certainement le plus utilisé est le détecteur UV-visible qui convient pour la plupart des applications. Il existe aussi, pour les applications particulières, le détecteur à fluorimétrie qui n'est applicable qu'aux molécules fluorescentes auxquelles il est sensible et sélectif. C'est un système de détection de choix pour l'analyse en toxicologie des antimalariques et de l'acide lysergique (LSD). Le dernier système classique est la détection électrochimique, pour la détection des ions en chromatographie ionique. Il est dédié à la détection coulométrique des acides aminés et neurotransmetteurs endogènes. On peut néanmoins réaliser le dosage de la buprénorphine en toxicologie, mais aussi celui des opiacés naturels tels que la morphine et la codéine. L'introduction dans les années 80 du détecteur à barrette de photodiodes (BD) a ouvert une nouvelle voie d'approche pour les utilisateurs de la HPLC. Cette méthode de plus en plus utilisée est nécessaire dans les laboratoires de toxicologie ainsi qu'auprès de l'industrie pharmaceutique. Dans le cadre d'une utilisation en toxicologie, le but est l'identification de composés inconnus, en se basant à la fois sur le temps de rétention des dits composés mais aussi sur leurs caractéristiques spectrales. La HPLC a l'avantage de permettre l'accès à des molécules instables thermiquement ou non volatiles qui ne peuvent pas être analysées par CPG-SM. La HPLC-BD et CPG-MS représentent deux méthodologies de recherche différentes qui sont à la fois additives et complémentaires. La puissance d'une méthode d'identification en HPLC-BD dépend de sa capacité à séparer les constituants d'un mélange complexe mais surtout de sa capacité à identifier un pic préalablement isolé. L'avènement de nouvelles colonnes analytiques extrêmement stables, de système de pompage à faibles volumes morts, d'enceintes de thermostatisation des colonnes a stabilisé le temps de rétention, permettant une recherche et identification des composées en se référant à des bases de données spectrales actuellement disponibles sur le marché. L'amélioration de la performance vient aussi de la qualité de la détection, à la fois sur la résolution (qualité de la richesse de l'information spectrale) et donc la spécificité, et sur la sensibilité (limite d'identification positive). Les systèmes HPLC-BD sont capables de détecter dans 98 % des cas les produis à des taux infra- thérapeutiques (et donc a fortiori infra-toxique). Les exceptions concernent la détection, uniquement à des taux supra-thérapeutiques, le buprénorphine, de la morphine, de l'halopéridol et de la buspirone, la mauvaise détection du LSD et la nondétection des cannabinoïdes. L'identification de toxiques courants tels que les neuroleptiques, les antidépresseurs ou les β-bloquants est de meilleure qualité avec la HPLC-BD. Enfin, d'introduction récente, le couplage de la chromatographie liquide au spectroscope de masse (HPLC-MS) est mis à disposition par plusieurs fabricants pour les appareillages dits de paillasse, c'est-à-dire de poids et d'encombrement réduits. Comme pour la CPG-MS, il existe différents appareils, dont les plus résolutifs sont les détecteurs magnétiques ou à bombardement d'atomes rapides mais inadaptés à la miniaturisation. Le type d'analyseurs courant sera la quadripôle. La différence avec la CPG tient à l'état du milieu. En HPLC le détecteur doit traiter un échantillon liquide. L'ionisation des composés s'effectue après désolvatation de l'échantillon. Ce sont des sources à nébulisation électrique qui génèrent la nébulisation à l'origine de la désolvatation. Afin d'augmenter le rendement d'ionisation, certaines sources sont assistées pneumatiquement par un courant d'air (ou d'azote) voire un deuxième source d'air chaud. Cette double assistance Page 12

14 pneumatique est efficace et convient pour l'ionisation de la majorité des analytes. Pour terminer, le couplage HPLC-MS/MS cherche à améliorer la spécificité en provoquant au sein du deuxième quadripôle une fragmentation et l'on isole dans un troisième quadripôle un ion issu de double fragmentation du produit à doser. Outre l'excellente spécificité d'un telle procédure, la sensibilité du dosage obtenu est parfait. Spectroscopie d'absorption et d'émission atomique La spectrométrie d'absorption atomique (SAA) en flamme ou en four et la spectrométrie d'émission à plasma inductif (EPI) sont utilisées pour l'analyse des éléments métalliques dans les milieux biologiques. Le choix du type de spectromètre dépend de l'utilisation envisagée. Sur le plan analytique, les deux technique sont complémentaires. Les techniques en flamme sont recommandées pour les volatils et les métaux tels que le plombe, le cadmium, le zinc, le sodium, le potassium et le lithium. Les techniques en four sont sensible et conviennent à la majorité des éléments, comme l'epi, préférées cependant pour la recherche des éléments réfractaires (terres rares), pour le bore, le phosphore, l'aluminium, le baryum et le titane. Le four présente l'avantage d'une faible consommation de l'échantillon (100 à 200 µl) tandis que la flamme mais également EPI consomment généralement plusieurs millilitres par minute. Page 13

15 Deuxième partie Substances chimiques Alcool éthylique * L'alcool éthylique ou éthanol est un toxique malheureusement banal en France puisque l'on y consomme encore 11,5 litres d'alcool pur par habitant et par an. Les boissons alcooliques font partie de notre culture et de notre alimentation, mais la toxicité de l'éthanol qu'elles contiennent est trop souvent minimisée, ce qui explique la fréquence des troubles et accidents graves dus à l'ivresse ou à l'éthylisme chronique. D'autre part, l'éthanol interagit avec de nombreux médicaments, notamment les psychotropes, très largement consommés par la population française. Les intoxications professionnelles sont rares. Son usage thérapeutique se limite au traitement des intoxication par le méthanol ou par l'éthylène glycol. Certains formes pharmaceutiques comme lotions, bain de bouche, sirops, etc. en continent des quantités parfois non négligeables. Prélèvements Le dosage de l'éthanol dans le sang répond aux préoccupations suivantes : le contrôle de l'imprégnation alcoolique, la répression de l'ivresse publique, le bilan toxicologique d'urgence, l'expertise toxicologique après l'autopsie. Chez le vivant, le prélèvement s'effectue par ponction veineuse au pli du coude, après nettoyage de la peau par un désinfectant ne contenant aucun alcool ni substance volatile. Cela uniquement pour éviter toute contestation ultérieure, car il a été démontré que la désinfection de la peau à l'alcool n'avait aucune influence sur le résultat. Les tubes à prélèvement sous vide contenant du fluorure de sodium et d'oxalate de potassium sont parfaitement adaptés. * La source bibliographique principale est le [5] et le [6]. Page 14

16 S'il existe pas de différence significative entre la teneur en éthanol du plasma et celle du sérum, elle a bien été mise en évidence entre le plasma ou sérum et le sang total. Une étude portant sur 134 échantillons montre que le rapport éthanol plasma/sang est en moyenne de 1,15. Ceci est tout à fait cohérent avec le fait que la teneur en eau du plasma est de 12 à 18 % supérieur à celle du sang total. L'urine est facile à recueillir et il est tentant de vouloir remonter de l'alcoolurie à l'alcoolémie. Cependant, seules des études d'extraction extrêmement contrôlées permettraient de faire une telle relation. Seule la comparaison avec l'alcoolémie serait interprétable : un rapport alcoolurie/alcoolémie bas indique que l'individu était en phase d'absorption au moment des prélèvements. Au contraire, un rapport élevé montre que la phase d'élimination était déjà entamée. La salive est parfois utilisée aux États-Unis pour le dépistage de l'état alcoolique des conducteurs. Un test colorimétrique permet d'obtenir un résultat semi-quantitatif. Le rapport alcool salive/sang va de 0,84 à 1,36. Le dépistage de l'éthanol dans l'air alvéolaire expiré est effectué par les forces de l'ordre. Il est démontré que le rapport théorique d'éthanol air/sang est de 1/2100 avec des grandes variations individuelles allant de 1/900 à 1/3400. Marqueurs directs Éthanol La dosage de l'éthanol par des méthodes chimiques ont été mises au point dès le début du siècle. Elles nécessitent une étape de séparation de l alcool par distillation ou diffusion, suivie d'un dosage par un oxydant. C'est Cordebard qui donne son nom à la méthode officielle publiée en 1955 et toujours en vigueur. Ces méthodes ont pour avantages d'être bon marché tant en investissement qu'en réactifs. Cependant, elles ont le gros inconvénient de ne pas être spécifique en dosant tous les corps réducteurs volatiles présents dans l'échantillon. Il n'existe pas de méthode immunochimique permettant le dosage de l'éthanol sanguin. En revanche, les méthodes enzymatiques sont très utilisées dans les laboratoires. La méthode initiale date de Une revue critique étudiant des trousses utilisables en France sur le dosage de l'éthanol plasmatique par voie enzymatique démontre qu'elles ne sont pas totalement spécifiques : l'isopropanol, l'alcool butylique et le méthanol dans le moindre mesure produisent de faux positifs. Leurs avantages tiennent dans la rapidité et dans la facilité de leur mise en œuvre sur les automates de biochimie. Leurs inconvénients sont principalement une médiocre exactitude dont on peut se satisfaire en clinique, et leurs défauts de spécificité en rendant l'utilisation totalement inacceptable pour un usage médico-légal. Les méthodes officielles de contrôle d'alcoolémie en France sont la distillation selon Cordebard et la chromatographie en phase gazeuse (CPG). Éthyl glucuronide Après l'administration, l'éthanol essentiellement métabolisé par le fois, les reins, les poumons et la peau pour donner de l'eau et le gaz carbonique. Une très faible quantité d éthanol (moins de 0,5 %) peut être éliminée sous forme d'éthyl glucuronide (EtG). L'intérêt majeur de l'etg est d'augmenter la fenêtre de détection de l'éthanol. En effet, on trouve ce métabolite dans le sang alors que tout l'éthanol a déjà été éliminé. Dans les urines, l'etg est détectable jusqu'à 80 heures après l'exposition. Les méthodes analytiques pour détecter l'etg est la chromatographie soit gazeux (CPG) soit liquide (HPLC-MS/MS). À ce jour, le dosage de l'etg dans les cheveux constitue l'approche la plus pertinente pour la caractérisation de la consommation excessive de boisson Page 15

17 alcoolisée. Il n'existe pas encore d'harmonisation sur le seuil de positivité puisque la littérature mentionne des seuils allant de 20 à 50 pg/mg. Éthyl sulfate Tout comme l'etg, éthyl sulfate (EtS) est un métabolite mineur de l'éthanol. Même si la fenêtre de détection de l'éthanol se trouve allongée, l'ets ne présente que peu d'intérêt par rapport à l'etg. Son dosage est réalisé par la chromatographie gazeuse ou liquide. Esters éthyliques d'acides gras Les esters éthyliques d'acides gras (FAEE) sont un groupe de vingtaine de substances comme l'éthyl laurate, l'éthyl myristate, l'éthyl palmitate ou encore éthyl stéarate. Ils sont détectables dans le sang 24 heures après l'arrêt de la consommation de l'éthanol et donc l'analyse pratique des FAEE est limitée à sa recherche dans les cheveux en complément de l'etg. En revanche, la caractérisation de l'alcoolisme fœtal à partir des analyses des FAEE dans le méconium semble promise à un avenir certain. Cette approche apparaît pertinente puisqu'elle permet un recul sur le rapport de la mère avec l'alcool sur environ 3 mois avant l'accouchement. La méthode communément utilisée est la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-MS). Phosphatidyléthanol Ce phospholipide est formé par l'action de la phospholipase D en présence d'éthanol. Il s'agit d'un marqueur spécifique dont la normalisation est de l'ordre de 15 jours après l'abstinence. C'est un marqueur très utilisé en Suède pour discriminer dans le sang d'autopsie les consommateurs d'alcool. Son dosage apparaît complexe et fait appel à la chromatographie liquide. Marqueurs indirects Marqueurs biochimiques VGM, γ-gt, ALAT et ASAT sont des paramètres largement utilisés comme marqueurs de surveillance de consommation et de désintoxication. Deux informations doivent doivent être recherchées : leurs spécificité et le délai de normalisation après l'abstinence à la consommation alcoolique. L'augmentation de volume globulaire moyen (VGM) au dessus de 98 fl constitue un argument en faveur de la consommation chronique d'éthanol. Cependant l'élévation du VGM peut avoir d'autre étiologie chez certaines personnes : carence en vitamine B12 et/ou folate. La spécificité serait de l'ordre de 40 à 90 % et sa normalisation est obtenue après une abstinence de 10 à 12 semaines. La gamma glutamyl transférase (γ-gt) est une enzyme inductible par l'éthanol mais aussi par les médicaments tels que barbituriques, phénytoïne, imipraminiques, antidépresseurs, etc. La γ-gt est élevée dans dans 35 à 90 % des cas d'alcoolisme, mais aussi dans de nombreuses pathologies hépato-biliaires. L'abstinence permet sa normalisation sous une quinzaine de jours. Les aminotransférases ALAT et ASAT, sont des marqueurs d'une souffrance hépatique. Localisées dans les hépatocytes périportaux, leur élévation sérique traduit une altération de la membrane cellulaire. Leur détermination pour la détection de l'éthylisme chronique est d'un intérêt limité. Page 16

18 Transferrine déficiente en carbohydrates (CDT) La transferrine est une glycoprotéine synthétisée par le foie et impliquée dans la transfert du fer. Elle possède deux chaînes polysaccharidiques plus ou moins ramifiées avec des résidus d'acide sialique. À l'état physiologique la forme tétrasialo-transferrine (n = 4) est majoritaire. En cas d'exposition prolongée à l'éthanol c'est les formes asislo- (n = 0), monosialo- (n = 1) et disialotransferrine (n = 2) sont affectées à la hausse, ce qui conduit à la formation d'isoformes de la transferrine déficiente en carbohydrates (CDT). Chez un sujet naturellement abstinent, le taux de CDT doit être inférieur à 1,3 % (seuil de positivité pour l'électrophorèse capillaire), chiffre qui va rapidement augmenter lorsque la consommation d'éthanol pur est supérieure à 50 g d'alcool par jour et pendant au moins 8 jours. La demi-vie de la CDT est en moyenne 17 jours, ce qui constitue un index intéressant dans le suivi d'alcoolisme y compris alcoolisme intermittent. C'est aussi un marqueur très sensible pour repérer la rechute chez les personne alcoolo-dépendantes. Après 3 semaines d abstinence chez un sujet consommateur d'alcool son taux se normalise. La sensibilité de ce marqueur est estimée à 70 %. C'est actuellement le marqueur de consommation excessive d éthanol le plus performant. La spécificité de la CDT est supérieure à celle des autres marqueurs classiques indirects. Cependant, quelques facteurs sont susceptibles de conduire à la hausse de la CDT sans qu'il y ait une exposition à l'éthanol : les carences martiales, la grossesse, le syndrome de déficience génétique en carbohydrates des glycoprotéines et certaines pathologies hépatiques. Le dosage de la CDT est réalisé exclusivement sur un échantillon sanguin. Différentes méthodes sont décrites dans la littérature où dominent la chromatographie liquide, l'électrophorèse capillaire et l'immunoanalyse. Toutes les études semblent indiquer que ces tests sont suffisamment robustes pour la réalisation des dosage en routine. En pratique? De l'ensemble des considérations développées ci-dessus et à partir de revue de la littérature, il apparaît qu'il n'existe pas de marqueur unique doté d'une spécificité et sensibilité à 100 %. Il en résulte que certains auteurs préconisent une combinaison simultanée de deux marqueurs. Il convient également de déterminer d emblée la situation clinique ou médico-légale qui a motivé l'investigation. En effet, à chaque situation doit correspondre une réponse adaptée. Le tableau 2 synthétise les caractéristiques des marqueurs directs et indirects. Page 17

19 marquer matrice sensibilité spécificité délai de normalisation Éthanol EtG sang, urines, air expiré - sang - urine - cheveux 100 % 100 % quelques heures variable selon le seuil de positivité 100 % - quelques heures - quelques jours - suivi par segmentation EtS cf. EtG cf. EtG cf. EtG cf. EtG FAEE cheveux suivi par segmentation VGM sang % % 2 à 3 mois γ-gt sérum % % 15 jours CDT sang, sérum % % 3 semaines Tableau 2. Les caractéristiques des différents marqueurs. Nicotine Bien que les conséquences du tabagisme actif soit connues depuis longtemps chez l'adulte, il faut attendre le début des années 1970 pour voir apparaître la notion de tabagisme passif notamment chez les enfants et de risque encouru par l'entourage de fumeurs en milieu professionnel. L'intoxication tabagique, quel qu en soit l'origine, peut être évaluée par la mesure d'un certain nombre de marqueurs dans les milieux biologiques. De façon idéale, un marqueur doit être spécifique de la consommation du tabac et suffisamment sensible pour permettre une analyse au laboratoire, avoir une demi-vie assez longue, reposer sur des prélèvements facilement obtenus et réalisable par des méthodes de dosage simples et peu coûteuses. Parmi ceux-ci on peut distinguer des marqueurs spécifiques de la consommation de tabac (nicotine, conitine) et des marqueurs non spécifique pouvant avoir d'autres origines que la fumée de la cigarette (thiocyanates, monoxyde de carbone). La conitine, métabolite principal de la nicotine, est aujourd'hui reconnu de manière consensuelle comme étant le meilleur indicateur de l'exposition au tabagisme et en particulier pour le dépistage du tabagisme passif. Prélèvement En pédiatrie comme en santé au travail, l'urine demeure à ce jour la matrice biologique de choix pour évaluer le degré d'exposition au tabagisme passif. La facilité de recueil d'un échantillon urinaire rend compatible son usage dans la population générale soumis à un environnement tabagique même si d'autres matrices font depuis quelques années l'objet de travaux. Le dosage de la conitine dans le méconium peut présenter un intérêt pour évaluer l'exposition anténatale d'un nouveau-né au tabagisme passif. L'analyse dans le méconium a l'avantage d'être une approche non invasive et de permettre une évaluation historique du niveau d'exposition du nouveauné pendant sa vie fœtale, pouvant remonter jusqu'à 2 semaines avant la naissance. Page 18

20 À coté des matrices citées ci-dessus, la salive apparaît comme une alternative intéressante pour le suivi d'exposition en santé au travail et en environnement. Elle présente de nombreux avantage mais on restera cependant prudent dans l'interprétation des résultats salivaires sachant que les concentrations de la conitine dans la salive dépendent de la production de salive. Dosage de la conitine : quelles méthodes analytiques? De nombreuses méthodes analytiques ont été décrites pour doser la conitine dans les matrices biologiques. Elles peuvent être classées en trois catégories : les méthodes colorimétriques, séparatives et immunologiques. Du fait des faibles concentrations de conitine attendues chez les sujets exposées passivement à la fumée de tabac comparativement aux sujets fumeurs actifs (concentrations de conitine de 50 à 100 fois plus importantes), le choix d'une techniques bien adaptée à cette contrainte doit se faire sur deux critères : une bonne spécificité et une limite de détection et de quantification de l'ordre de quelques ng/ml. Colorimétrie Les méthodes colorimétriques sont des techniques mettant en déviance les métabolites de la nicotine par révélation des molécules à noyau pyridine. Bien que cette technique soit simple, rapides, peu coûteuse et facilement automatisable, elle soufre d'un inconvénient majeur : sa limite de détection n'est pas suffisamment basse pour être pratiquée dans le cas d'évaluation de l'exposition d individus au tabagisme passif. Techniques séparatives Les méthodes séparatives sont constituées pour l'essentiel de méthodes chromatographiques telles que la chromatographie liquide haute performance (HPLC) associée à un détecteur UV ou à un détecteur à barrette de diodes (BD), voire à un détecteur de masse (MS ou MS-MS) et la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-MS). D'une manière générale, ces méthodes bénéficient d'une limite de quantification basse et sont caractérisées par une grande spécificité. En faisant une revue de la bibliographie, il apparaît clairement donc que les méthodes séparatives sont capables de répondre efficacement à la problématique du tabagisme passif. Certains auteurs utilisent une méthode HPLC-BD dont la limite de quantification était de 1 ng/ml ; le seuil de positivité permettant de distinguer les sujets exposés, des sujets non exposés était de 6 ng/ml. Pour compléter ce point, nous citerons des méthodes de quantification par CPG- MS avec une limite à 1,5 ng/ml dans le plasma ou des méthodes basées sur le dosage de conitine urinaire par HPLC-MS-MS dont la limite de quantification est de 0,1 ng/ml. Immunochimie Il en ressort des données de la littérature que les tests Radio immuno Assy (RIA), avec des limites de quantification basses, est une méthode performante pour le dosage de la conitine pour contrôler l'exposition au tabagisme passif. Elle souffre toutefois de plusieurs inconvénients liés principalement au temps d'analyse élevé, à l'équipement spécifique ainsi qu'aux agréments nécessaires à sa mise en œuvre étant donné l'emploi de la conitine radio-active. En ce qui concerne les autres tests immunoanalyse, en 2005, les travaux sur la conitine du «groupe de travail» mixte des Sociétés françaises de la Biologie Clinique et de la Toxicologie Analytique (respectivement SFBC et SFTA), concluaient après une évaluation des trousses disponibles sur le marché, que ces tests présentaient une imprécision importante pour les concentration dans l'urine inférieures à 200 ng/ml, rendant inappropriée leur utilisation pour le Page 19