Applications du NGS à la pathologie tumorale
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- Benjamin Lecompte
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1 Applications du NGS à la pathologie tumorale Dre Bettina Bisig Institut de Pathologie CHUV Lausanne 29 septembre 2016
2 PATHOLOGIE TUMORALE
3 HE Examen macroscopique Bloc FFPE Coupes Lames blanches (non colorées) FFPE = formalin-fixed paraffin-embedded
4 Morphologie (HE)
5 Morphologie (HE) Examen macroscopique Bloc FFPE Coupes Lames blanches (non colorées) Analyses moléculaires FFPE = formalin-fixed paraffin-embedded
6 Mutations Sequençage petites insertions/délétions Translocations FISH enrichissement sur lame in vitro (ADN) in situ (ADN) Analyses d expression Immunohistochimie Copy number variations in situ (protéines) in situ (ADN)
7 Mutations Sequençage petites insertions/délétions enrichissement sur lame in vitro (ADN) Translocations FISH BIOMARQUEURS in situ (ADN) Analyses d expression DIAGNOSTIQUES PRONOSTIQUES Immunohistochimie PREDICTIFS Copy number variations in situ (protéines) in situ (ADN)
8 Biomarqueurs PRONOSTIQUES Biomarqueurs PREDICTIFS Prédisent la survie indépendamment grade du traitement LVI Prédisent la réponse à un traitement déterminé
9 MÉDECINE PERSONNALISÉE BIOMARQUEURS PREDICTIFS Bayer Healthcare
10 ADENOCARCINOMES PULMONAIRES Env. 15%: mutation EGFR EGFR Mutation activatrice du domaine tyrosine kinase de l EGFR Activation constitutive de la signalisation Prolifération, survie, invasion, Hudis CA, NEJM 2007
11 ADENOCARCINOMES PULMONAIRES Env. 15%: mutation EGFR EGFR Inhibiteurs de l EGFR: Gefitinib / erlotinib Hudis CA, NEJM 2007
12 groupe EGFR muté = meilleure survie avec gefitinib (versus chimio standard) (progression-free survival = survie sans progression) groupe EGFR wild-type = moins bonne survie avec gefitinib (versus chimio standard)
13 ADENOCARCINOMES PULMONAIRES Env. 15%: mutation EGFR EGFR = BIOMARQUEUR PREDICTIF Hudis CA, NEJM 2007
14 ADENOCARCINOMES PULMONAIRES TCGA, Nature 2014
15 ADENOCARCINOMES PULMONAIRES T Mitsudomi, Nat Rev Clin Oncol 2013
16 CARCINOMES PULMONAIRES: Médicaments disponibles ou en cours de développement Thérapies Ciblées
17 Mutations Sequençage petites insertions/délétions on-slide tumor enrichment in vitro (DNA) Translocations THERAPIES CIBLEES in situ (DNA) FISH Expression analysis Immunohistochemistry BIOMARQUEURS Copy number variations PREDICTIFS in situ (proteins) in situ (DNA)
18 Bloc épuisé
19 Nombre croissant d altérations moléculaires «actionnables» Techniques moins invasives de prélèvement Nombre croissant d analyses moléculaires Taille de plus en plus petite des échantillons Augmentation des délais (TAT) Augmentation des coûts Epuisement des échantillons tissulaires / cellulaires Sensibilité technique relativement faible (20-30% cell. tum.)
20 Nombre croissant d altérations moléculaires «actionnables» Nombre croissant d analyses moléculaires SOLUTION? Taille de plus en plus petite des échantillons Augmentation des délais (TAT) Augmentation des coûts Epuisement des échantillons tissulaires / cellulaires Techniques moins invasives de prélèvement Sensibilité technique relativement faible (20-30% cell. tum.)
21 NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS) Multiples altérations moléculaires dans un seul run Multiples échantillons dans le même run Sensibilité analytique élevée Remplace le séquençage classique et Gestion optimale des échantillons tissulaires/cellulaires Délais et coûts diminués Sensibilité accrue (5-10% cell. tum.)
22 NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS) Capable de détecter: Mutations Insertions/deletions Translocations Gains / pertes (CNV)
23 GENOME EXOME «HOTSPOTS» TRANSCRIPTOME Simon and Roychowdhury, Nat Rev Drug Discover 2013 SEQUENÇAGE CIBLÉ (TARGETED SEQUENCING)
24 SPECIFICITÉS DU NGS SUR TISSU TUMORAL - Tissu fixé (FFPE): ADN dégradé - Biopsies: quantité limitée - Tissu hétérogène: hétérogénéite génétique cellules tumorales et non Fréquences alléliques très variables Enrichissement en cellules tumorales (manuel / laser) - Altérations somatiques versus germinales
25 CARCINOMES PULMONAIRES: Médicaments disponibles ou en cours de développement Thérapies Ciblées
26 ADENOCARCINOMES PULMONAIRES EGFR ALK ROS1 BRAF HER2 RET MET KRAS PIK3CA NTRK1 NRG1 FGFR1 1 ère LIGNE de TTT (=TTT STANDARD) 2 ème LIGNE de TTT (évt. OFF-LABEL) TTT dans des ETUDES CLINIQUES
27 PANELS DE BIOMARQUEURS PETIT PANEL PANEL MOYEN GRAND PANEL LIGNES DE TRAITEMENT 1 ère LIGNE de TTT 2 ème LIGNE de TTT TTT dans des ETUDES CLINIQUES
28 PLATEFORME NGS - STRATEGIE IPA LAUSANNE Pathology target population PHASE 1 Molecular oncology PHASE 2 reports, consult., tumor boards Classical Sequencing Next Generation Sequencing Clinical Trials Small cancer panel (50 genes) Large cancer panel (400 genes) Ion Torrent PGM Illumina MiSeq Smaller number of genes, 10ng DNA Larger number of genes, ng DNA
29 PETIT PANEL TUMEURS SOLIDES - 52 GENES Séquenceur Ion Torrent PGM Panel de gènes Ion AmpliSeq Custom Cancer Hotspot Panel IPA (Cancer Hotspot Panel v2 lég. modifié) 52 gènes (hotspots), 218 amplicons mutations/indels, 23.9 Kb 10 ng ADN par échantillon ABL1 CDH1 ERBB2 FGFR3 HRAS KIT NOTCH1 PTPN11 SRC AKT1 CDKN2A ERBB4 FLT3 IDH1 KRAS NPM1 RB1 STK11 ALK CSF1R EZH2 GNA11 IDH2 MAP2K1 NRAS RET TP53 APC CTNNB1 FBXW7 GNAQ JAK2 MET PDGFRA SMAD4 VHL ATM DDR2 FGFR1 GNAS JAK3 MLH1 PIK3CA SMARCB1 BRAF EGFR FGFR2 HNF1A KDR MPL PTEN SMO
30 PETIT PANEL GENES DE FUSION - 4 GENES / >50 TRANSCRITS Séquenceur Panel de gènes Ion Torrent PGM Ion AmpliSeq RNA Fusion Lung Cancer Research Panel - 4 gènes, >50 transcrits de fusion 85 amplicons 10 ng ARN par échantillon ALK RET ROS1 NTRK1 >50 transcrits de fusion
31 GRAND PANEL TUMEURS SOLIDES GENES Séquenceur Panel de gènes MiSeq / Illumina LARGE CANCER PANEL 400 gènes (exons) mutations/indels translocations gains/pertes (50 ng ADN)
32 Amplicon-based Capture-based Ion Torrent, Life Technologies
33 PANEL LYMPHOMES T PERIPHERIQUES Séquenceur Panel de gènes Ion Torrent PGM Custom Panel Ion AmpliSeq 9 gènes (hotspots ou séq. codantes) 262 amplicons, 28.7 Kb 20 ng ADN par échantillon (2x10 ng) Gènes CD28 DNMT3A IDH2 PLCG1 RHOA SETD2 STAT3 STAT5B TET2 Exons Ex 2&4 Plusieurs (16x) Ex 4 Tous (21x) Ex 2 Tous (21x) Ex 20 & 21 Ex 16 Tous (11x) Cible Hot spots Hot spots Hot spots Séq. codante Hot spots Séq. codante Hot spots Hot spots Séq. codante
34 PANEL BRCA1 + BRCA2 Séquenceur Panel de gènes MiSeq / Illumina BRCA Tumor MASTR TM Plus Dx (Multiplicom) Gènes BRCA1 + BRCA2 (séquences codantes complètes) ( ng ADN)
35 Mutations small insertions/délétions on-slide tumor enrichment Sequençage in vitro (DNA) Translocations FISH in situ (DNA) NEXT GENERATION SEQUENCING Copy number variations in situ (DNA)
36 DÉFIS Stockage des données Analyse des données INFORMATIQUE SOCIETE SUISSE DE PATHOLOGIE MOLECULAIRE GROUPES DE TRAVAIL REGIONAUX/NATIONAUX Hétérogénéité tumorale Traduction dans la prise en charge clinique RESEAU PATHOLOGIE / ONCOLOGIE DONNEES DE SEQUENÇAGE Découverte fortuite altérations germinales BIOINFO / PIPELINES ANALYTIQUES SWISS INSTITUTE BIOINFORMATICS Altérations à basse fréq. allélique MODELISATION PROTEINES Nouvelles altérations GENETIQUE
37 DEVELOPPEMENTS: BIOPSIES LIQUIDES ADN TUMORAL CIRCULANT (ctdna) Bettegowda et al, Sci Transl Med 2014
38 DEVELOPPEMENTS: IMMUNOTHERAPIE CHARGE MUTATIONNELLE (MUTATIONAL LOAD) REPONSE A L IMMUNOTHERAPIE Dr E. Missiaglia
39 DEVELOPPEMENTS: IMMUNOTHERAPIE PERSONNALISEE NEOANTIGENES TUMORAUX EXPANSION EX VIVO DE LYMPHOCYTES T SPECIFIQUES ou VACCINS SPECIFIQUES
40 CONCLUSIONS
41 CONCLUSIONS NGS EN PATHOLOGIE TUMORALE: - Multiples biomarqueurs et multiples échantillons - Mutations, translocations, gains, pertes - Sensibilité accrue - Remplace les techniques habituelles et au delà - Recherche clinique et translationnelle - Défis et développements
42 REMERCIEMENTS INSTITUT DE PATHOLOGIE, CHUV Prof. Laurence de Leval Labo de biologie moléculaire Dr sc. Edoardo Missiaglia Dr sc. Audrey Letourneau Dr sc. Nathalie Scamuffa Véronique Roux Samuel Rappo Paola Izzo Robin Russi Véronique Vocat Dr sc. Patricia Hornitschek Soheyb Sellah Jérémy Vidal DEPARTEMENT D ONCOLOGIE, CHUV Prof. Olivier Michielin Dr K. Homicsko Labo de FISH Labo d immunohistochimie Labo d histologie
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