Rapport sur le stage effectué du 21 Mai 2012 au 20 Juin A l Institut de Biologie Structurale (IBS)

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1 ZAMORANO Natalia Université Joseph Fourier L1 Rapport sur le stage effectué du 21 Mai 2012 au 20 Juin 2012 A l Institut de Biologie Structurale (IBS) Au sein du groupe Réponse Immunitaire aux Pathogènes et au Soi Altéré (IRPAS) A Grenoble ETUDE DE L INTERACTION ENTRE UNE PROTEINE DU COMPLEMENT, LA L- FICOLINE, ET UNE PROTEINE DE SURFACE DE Streptococcus pneumoniae, LA CHOLINE BINDING PROTEIN E Discipline : Biologie Structurale Maître de stage : Émilie STERMANN

2 REMERCIEMENTS Je tiens à remercier Nicole Thielens de m avoir accueillie dans son laboratoire au cours de ce stage et Philippe Frachet, sans qui je n aurais pas eu l opportunité d être ici. Je remercie Emilie Stermann, mon maître de stage, pour avoir bien voulu m encadrer, pour son expertise et pour tous les enseignements qu elle m a transmis au cours de ce stage. Je lui suis extrêmement reconnaissante pour la confiance qu elle m a accordée, pour tous ses conseils, ses explications et ses remarques. Grâce à elle, cette expérience a été plus qu enrichissante. Je remercie chaudement Monique Lacroix, Evelyne Gout, Mickaël Jacquet, Mélanie Verneret, Sarah Ancelet, Jean-Pierre Andrieu et Anne-Marie Di Guilmi pour m avoir permis de m investir dans différentes expériences. Je tiens également à remercier toutes les personnes qui font partie du laboratoire et de l institut et qui, d une façon ou d une autre, ont fait de ce stage une expérience inoubliable.

3 SOMMAIRE ABREVIATIONS I INTRODUCTION 1. L IBS et l IRPAS 2. Généralités sur l immunité 2.1 L immunité innée 2.2 La ficoline L 2.3 La Choline Binding Protein E 3. Le projet de stage II PRODUCTION ET PURIFICATION DES CBPS RECOMBINANTES ET INTERACTION AVEC LA FICOLINE L 1. Principe des techniques utilisées 1.1 La chromatographie d affinité 1.2 L électrophorèse SDS-PAGE 1.3 La dialyse 1.4 Le test ELISA 2. Matériel et méthodes 2.1 Production de la ficoline L 2.2 Cultures bactériennes et production des protéines 2.3 Purification des protéines par chromatographie d affinité 2.4 Dialyse 2.5 Le test ELISA 3. Résultats et discussion 3.1 Production et purification du domaine de liaison à la choline Cbd et du domaine catalytique Pce de CbpE Chromatographie d affinité du domaine Cbd Analyse électrophorétique de la purification du domaine Cbd Chromatographie d affinité du domaine catalytique Pce Analyse électrophorétique de la purification du domaine catalytique Pce 3.2 Élimination de l Imidazole par dialyse 3.3 Analyse des interactions entre la ficoline L et le domaine catalytique Pce par ELISA III CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES APPRECIATIONS PERSONNELLES BIBLIOGRAPHIE

4 ABREVIATIONS AA Cbps CbpE Cbd CEA CNRS Da DO DTT IBS IPTG IRPAS LB LTA MASP MBL Pce PCho PM Rpm SDS SDS-page TA TEMED Tris UJF WT Acides Aminés Choline-binding Proteins Choline-binding Protein E Choline binding domain Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives Centre national de la recherche scientifique Dalton Densité optique Dithiothreitol Institut de Biologie Structurale Isopropyl-β-D-thiogalactopyrannoside groupe Réponse Immunitaire aux Pathogènes et au Soi Altéré Luria-Bertani (LB) (Milieu de culture) Acide lipotéichoïque MBL associated serine protease Mannan Binding Lectin Phosphorylcholine Esterase Phosphocholine Poids Moléculaire Rotations par minute Dodécylsulfate de sodium Électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS Acide téichoïque N,N,N,N -tétraméthyléthylènediamine Tris-hydroxyméthyl-aminométhane Université Joseph Fourier Wild Type/souche sauvage

5 I INTRODUCTION 1. L IBS et l IRPAS L institut de Biologie Structurale (IBS) est un centre de recherche dont l objectif principal est la compréhension des mécanismes biologiques fondamentaux. A partir de 1999, il est considéré comme une unité mixte de recherche CEA-CNRS-UJF. Le groupe Réponse Immunitaire aux Pathogènes et au Soi Altéré (IRPAS) fait partie des quinze groupes de recherche à l IBS. C est au sein de ce laboratoire que j ai réalisé mon stage, plus précisément, dans l équipe Protéines de l immunité innée à l interface hôte-pathogène. L objectif principal de l équipe est d approfondir les connaissances et la compréhension des interactions moléculaires de C1q, de la MBL et des ficolines à l interface hôte-pathogène. 2. Généralités sur l immunité L immunité est l ensemble de moyens de protection d un organisme multicellulaire contre les agressions externes (agents pathogènes) et internes (cancers, par exemple) ; l ensemble de cellules, tissus et molécules impliqués dans ces mécanismes de défense est appelé système immunitaire. Les mécanismes de défense se composent de l immunité naturelle ou innée, retrouvée dans tous les organismes multicellulaires et de l immunité adaptative, apparue beaucoup plus récemment et présente uniquement chez les mammifères, oiseaux, poissons, batraciens et reptiles (Thèse de doctorat de Florence Teillet, UJF, 2006). 2.1 L immunité innée L immunité innée est constituée de barrières naturelles de l organisme, de protéines sériques et d un ensemble de cellules résidant dans les tissus ou dans le sang. Ces acteurs interviennent dans les premières heures de l infection. La reconnaissance des cibles par les acteurs de l immunité innée permet la mise en place de deux systèmes effecteurs : le système du complément et la phagocytose. Par la suite, on se focalisera sur le système sérique du complément. Le système du complément est considéré comme un système sophistiqué de destruction des microorganismes à l interface entre immunité innée et adaptative (Thèse de doctorat de Virginie Garlatti, UJF, 2008). Trois voies différentes mènent à l activation du complément : la voie classique, la voie alterne et la voie lectine. Cette dernière est très similaire à la voie classique et son complexe d activation est composé de protéines multimérique de reconnaissance (MBL ou ficoline) associée à une protéase à sérine appelée MASP. Les ficolines sont des protéines de défense. Elles possèdent un domaine de reconnaissance de type fibrinogène et sont capables de discerner des signaux de danger, tels que des molécules exprimées à la surface de certains pathogènes. Il existe trois ficolines humaines : L, H et M. Notre intérêt se portera sur la ficoline L.

6 2.2 La ficoline L La ficoline L est une glycoprotéine multimérique formée de sous unités de 35KDa. C est une protéine plasmatique exprimée principalement dans le foie (Matsushita et al., 1996) et impliquée dans la reconnaissance de certains pathogènes. Plusieurs études ont montré que le système du complément pouvait être activé lorsque la ficoline L se liait à des protéines exprimées à la surface des microorganismes, tels que Streptococcus pneumoniae. (Thèse de doctorat de Virginie Garlatti, UJF, 2008) 2.3 La Choline Binding Protein E (CbpE) Les Choline-binding proteins (Cbps) sont un groupe de protéines dont la structure générale suit le modèle suivant : un peptide signal, un domaine N-terminal biologiquement actif et un domaine Cbd conservé qui fixe la phosphocholine (PCho) (Bergmann et Hammerschmidt, 2006). Les Cbps peuvent venir se lier de façon non covalente à la PCho, composant important de la paroi cellulaire des pneumocoques et rester ainsi ancrées à la paroi. Plus de 15 Cbps ont été identifiées dans des souches de pneumocoques et certaines jouent un rôle dans la virulence de ces pathogènes. Il a été montré que la CbpD, CbpE et CbpG sont impliquées dans la colonisation du nasopharynx. (Bergmann et Hammerschmidt, 2006). La CbpE est l un des membres les plus importants de la famille des Cbps. Elle appartient à la super famille des métallo-β-lactamases (Garau et al., 2005), car son site actif présente un ion métallique, le fer, et la position topologique de ce site est équivalente à celle observée dans d autres métalloβ-lactamases. La structure de la CbpE comprend un peptide signal de 26 AA, un domaine catalytique Pce lié par une séquence peptidique au Cbd de la région C-terminal. On s intéressera par la suite aux deux domaines principaux : le domaine catalytique (Pce) et le domaine qui fixe la choline (Cbd) (Garau et al., 2005). Le domaine catalytique (Pce) : L activité catalytique de la phosphocholine estérase enlève la PCho de la paroi cellulaire et cause ainsi des changements dans le phénotype des colonies bactériennes. Les informations structurales ont mis en évidence que les seuls résidus PCho accessibles à la Pce sont ceux situés dans les acides téichoïques (Bergmann et Hammerschmidt, 2006). Il a été par ailleurs démontré que le site actif de Pce contient deux atomes de fer dans son centre. Des études ont montré que l interaction entre la PCho et la Pce se produit entre les deux oxygènes du groupement phosphate de la PCho et les ions fer de Pce (Garau et al., 2005). Le domaine de liaison à la choline (Cbd) : Une étude menée à l IBS a montré que tous les Cbds sont formés par un motif répétitif GWX 6 WYYX 4 GXMX 2. Deux de ces formes répétitives constituent un site de fixation à la PCho. Il semblerait qu il y ait au total 4 poches accueillant cette molécule, laquelle provient certainement des acides téichoïques et lipotéichoïques (TA et LTA) de la paroi cellulaire des pneumocoques. Ce domaine reste encore très peu étudié et la littérature n est donc pas trop vaste.

7 Des modélisations ont été proposées pour montrer la façon dont le Pce et le Cbd se lient aux TA et LTA (Fig. 1) et laissent conclure que, bien que les substrats de ces deux domaines soient les mêmes (la PCho des TA et LTA), leurs rôles sont très différents. La Pce ayant une activité catalytique clive la PCho, alors que les poches du Cbd permettent de la fixer sans la cliver et restent ainsi associés aux TA et LTA de la paroi cellulaire (Garau et al., 2005). Fig. 1. Modèle proposé pour la reconnaissance de l acide téichoïque des pneumocoques par la CbpE. Le domaine Cbd a été modélisé. La surface de la protéine apparaît en gris. Trois chaînes de TA ont été modélisées (A, B et C), le début et la fin de chaque chaîne sont représentés par un s et un e, respectivement. Les chaînes polysaccharidiques ont été colorées en rouge (A), bleu (B), vert (C), et la PCho a été représentée en bleu sombre. Une chaîne d acide téichoïque a été représentée ancrée dans le site actif (image en haut à gauche). Une des PCho a été colorée en bleu sombre et l autre en cyan : cette dernière est en interaction avec les ions fer et pourra subir une éventuelle hydrolyse. Les ions fer sont montrés comme des sphères. (www.pymol.org/). (Garau et al., 2005). 3. Le projet de stage L objectif principal du projet est d étudier les interactions entre la ficoline L, protéine impliquée dans l activation du complément, et la choline binding protein E (CbpE), une protéine présente à la surface de certaines souches de pneumocoques. Plus spécifiquement, il s agit de déterminer quel domaine spécifique de la CbpE est engagé dans cette interaction. De ce fait, nous allons mettre en culture des bactéries recombinantes, capables d exprimer les deux principaux domaines de la protéine, soit le Cbd et le Pce. Après purification des domaines recombinants, nous allons analyser les interactions avec la ficoline L par des tests ELISA, et déterminer l implication de chaque domaine.

8 II PRODUCTION ET PURIFICATION DES CBPS RECOMBINANTES ET INTERACTION AVEC LA FICOLINE L 1. Principe des techniques utilisées 1.1 La chromatographie d affinité La chromatographie d affinité que nous allons utiliser s appelle IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography). Ce type de chromatographie fait appel à l immobilisation, sur une résine, d un atome métallique tel que le nickel. Lorsque cet atome est immobilisé, il peut établir des liens de coordination avec certains polypeptides, comme par exemple une chaîne d histidines. Les domaines que nous voulons étudier contiennent effectivement des tags histidine, ils vont donc rester accrochés à la colonne de nickel lors de leur passage. Fig. 2. Système de base de la chromatographie. La colonne est reliée au reste du système de façon à ce que les tampons la traversent de haut en bas. L avantage d avoir deux tampons est qu on peut programmer le système pour pomper progressivement plus d un tampon que de l autre, générant ainsi un gradient ou des paliers. Tampon A : tampon de charge. Tampon B : tampon d élution. En aval de la colonne, une cellule spectrophotométrique permet d'observer l absorbance UV pour détecter le passage des protéines. L éluat de la colonne est ensuite recueilli en petites fractions par un collecteur (Image tirée du site

9 Fig. 3. Grandes étapes de la chromatographie. 1) Chargement de la colonne avec le tampon correspondant (tampon A). 2) Dépôt de l échantillon. Les protéines d intérêt, contenant le tag histidine, resteront accrochées à la colonne. 3) Lavage avec le même tampon de charge pour éliminer tout ce qui ne s est pas accroché à la colonne. 4) Élution avec du tampon B qui contient une forte concentration d Imidazole. Ce composé entrera en compétition avec l histidine pour le nickel. Ainsi, plus on augmentera la concentration du tampon B, plus les protéines qui y étaient accrochées se dissocieront et seront récupérées dans l éluat. (Image tirée du site bl/5e1.html). 1.2 L électrophorèse SDS-PAGE Sous l effet du champ électrique, les protéines se déplacent vers le pôle de charge opposée à leur charge nette (z), à une vitesse proportionnelle à cette charge. En présence de SDS, toutes les protéines sont chargées négativement. La séparation va donc dépendre du poids moléculaire de la molécule, les plus petites migrant le plus loin. Le mélange contenant les protéines à étudier est chauffé en présence : d'un agent réducteur : le β-mercaptoéthanol ou le DDT qui réduisent les ponts disulfures. d'un détergent anionique fort : le sodium dodecyl sulfate (SDS) qui enveloppe les chaînes polypeptidiques des protéines de charges négatives. Ces charges se repoussent et déplient les chaînes polypeptidiques. En conséquence, les protéines sont dénaturées : elles ont perdu leur structure tridimensionnelle native et elles n'ont plus de ponts disulfures. Les protéines de l'échantillon sont ensuite séparées par une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS. On utilise un pourcentage d acrylamide de 10% car la taille des protéines qu on veut faire migrer est entre Kda. 1.3 La dialyse De façon générale, la dialyse est une technique utilisée pour l'élimination de petites molécules, le dessalage et les changements de tampon. Le système comporte un sac poreux ou boudin

10 contenant les molécules à séparer, qui sera immergé dans une solution tampon. Les molécules ayant des dimensions significativement plus grandes que le diamètre des pores sont retenues à l'intérieur du sac de dialyse, tandis que les molécules plus petites et les ions traversent les pores de la membrane et apparaissent dans le dialysat à l'extérieur du sac. 1.4 Le test ELISA Les anticorps peuvent être utilisés en tant que réactifs analytiques d'une extrême spécificité, pour quantifier une protéine ou un autre antigène. La technique est dénommée ELISA, c'est-à-dire dosage par immunoadsorbant lié à une enzyme. Cette méthode utilise une enzyme qui réagit avec un substrat non coloré pour donner un produit coloré. L'enzyme est lié par covalence à un anticorps spécifique qui reconnaît soit un antigène, soit un autre anticorps. Lorsque la cible est présente, le complexe anticorps-enzyme se fixera sur elle et après addition du substrat, l'enzyme catalysera la réaction aboutissant au produit coloré. Ainsi, la présence du produit coloré révèle la présence de l'antigène/anticorps. Lorsque le produit reconnu est un autre anticorps, on parle d'elisa indirect. Pour le différencier de l'elisa direct dont le principe est la reconnaissance d'antigènes. Fig. 4. ELISA indirec t. 1) Immo bilisati on de l'antig ène. 2) L'anticorps spécifique se fixe à l'antigène. 3) Le complexe anticorps-enzyme se fixe sur l'anticorps spécifique. 4) Addition du substrat et coloration du produit ; l'intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité d'anticorps spécifique. 2. Matériel et Méthodes 2.1 Production de la Ficoline L La production de la ficoline L a été réalisée par le laboratoire selon le protocole ci-dessous (M. Lacroix et al, 2008) : Des lignées cellulaires stables de CHO K1 exprimant la ficoline L ont été obtenues par des méthodes de génie et amplifiées dans un milieu de culture sélectif. Le surnageant est dialysé contre un tampon NaCl 145 mm, CaCl 2 5 mm, Tris-HCl 20 mm (ph 7.4). puis centrifugé à 8000 rpm 15 min à 4 C. Il est ensuite déposé sur une colonne de N-acétylcystéine- Sepharose. L élution de la ficoline L a été effectuée avec le même tampon contenant 0.3 M de N- acétyl-d-glucosamine (GlcNAc). La protéine purifiée a été dialysée contre un tampon NaCl 145 mm, CaCl 2 2 mm, tri-éthanolamine-hcl 50 mm (ph 7,4) et concentrée par ultrafiltration à 0.1 à 0,4 mg / ml. 2.2 Cultures bactériennes J = 0 Précultures des souches bactériennes exprimant les domaines Cbd ou Pce dans 20 ml de milieu de culture LB contenant de l ampicilline à 100µg/ml final ou de la kanamycine à 30µg/ml final à 37 C

11 sous agitation toute la nuit J + 1 Mise en culture des précultures dans 750 ml de milieu de culture LB contenant de l ampicilline à 100µg/ml final ou de la kanamycine à 30µg/ml final et incubation sous agitation à 37 C jusqu à ce que la DO 600nm soit supérieure à 1. La production des protéines est induite en ajoutant de l IPTG à 1mM final et en incubant toute la nuit à 15 C sous agitation. J + 2 Les milieux de culture sont centrifugés pendant 10 min à 4500 rpm à 4 C. Le surnageant est éliminé dans un bécher et les culots bactériens sont lavés avec 30 ml de tampon TBS, puis répartis dans des tubes Falcons de 50 ml et centrifugés à 3500 rpm pendant 20 min à 4 C. Les culots sont conservés à -20 C. J + 3 Le culot bactérien est repris dans 40 ml de tampon Tris 50 mm, NaCl 200 mm, Imidazole 20 mm, ph 8.dans lequel a été rajouté extemporanément une pastille d anti-protéase Complete La solution est transférée dans un bécher en métal entouré de glace, les bactéries sont soniquées à l aide d une macro-sonde pendant 2 min de façon discontinue (2s de sonication, 8s de pause). Les bactéries sont ensuite centrifugées à rpm pendant 20 min à 4 C (rotor JA-20). Le surnageant est récupéré et conservé dans la glace. 2.3 Purification des protéines par chromatographie d affinité J + 3 La purification est réalisée sur une colonne HisTrapFF (Fast Flow) de 1 ml. La colonne est rincée en eau à un débit de 1 ml/min puis équilibrée avec le tampon de charge Tris 50 mm, NaCl 200 mm, Imidazole 20 mm, ph 8 (Buffer A). L échantillon est chargé à 2 ml/min. L élution se fait par «Palier» avec 3 concentrations en Imidazole (60, 100 et 300mM respectivement) avec un tampon d élution Tris 50 mm, NaCl 200 mm, Imidazole 300 mm, ph 8 (Buffer B). Programme Chromatographie Step Start Step Number (ml) 1 0,0 Collect Fractions whitin 4 time window(s) ending at 115,0 ml 2 0,0 UV Zero Baseline 3 0,0 Isocratic Flow with 100% Sample, 0% buffer B at 2,00 ml/min for 40,0 ml 4 40,0 Isocratic Flow with 100% Buffer A, 0% buffer B at 2,00 ml/min for 40,0 ml 5 80,0 Isocratic Flow with 80% Buffer A, 20% buffer B at 1,00 ml/min for 10,0 ml

12 6 90,0 Isocratic Flow with 67% Buffer A, 33% buffer B at 1,00 ml/min for 10,0 ml 7 100,0 Isocratic Flow with 0% Buffer A, 100% buffer B at 1,00 ml/min for 15,0 ml 8 115,0 End of Protocol Collection Window Start (ml) End (ml) 1 0,0 40,0 5, ,0 90,0 1, ,0 100,0 1, ,0 115,0 1,00 Fraction Size (ml) Les fractions contenant la protéine sont conservées à 4 C avant d être analysées sur gel d acrylamide 10%. 2.4 Dialyse J + 4 Avant de faire la dialyse, on fait une migration des échantillons sur gel d acrylamide 10%. Les fractions les plus pures sont rassemblées et la DO à 280nm est mesurée. J + 5 2ml de la solution contenant la protéine est dialysée contre 1 l de tampon de dialyse : Tris 20 mm, NaCl 150 mm, PCho 5 mm, ph 8.à l aide d un boudin de dialyse avec un seuil de coupure de Da, sous agitation pendant 6 heures en chambre froide. Après 6 heures de dialyse, le contenu du boudin est transvasé dans un tube Eppendorf. La mesure du volume récupéré puis de l absorbance à 280nm après centrifugation 10min à rpm permet de déterminer la quantité de protéine purifiée. 2.5 Le test ELISA Le test d interaction développé au laboratoire est une variante du test ELISA. Dans un premier temps, la protéine d intérêt (Pce) est immobilisée sur un support solide (plaques pour microtitration). La protéine à tester (ficoline L) est mise en contact avec le support "fonctionnalisé" qui est ensuite lavé. L addition d un premier anticorps spécifique de la L-ficoline permet de détecter la fixation de la protéine à tester sur la protéine d intérêt. Après lavage, l ajout d un deuxième anticorps marqué à la peroxydase permet la reconnaissance du premier anticorps. L activité résiduelle est mesurée après incubation d une solution révélatrice (ECL) contenant le substrat de l'enzyme grâce à un luminomètre

13 3. Résultats et discussion 3.1 Production et purification du domaine de liaison à la choline Cbd et du domaine catalytique de la CbpE par chromatographie d affinité Chromatographie d affinité du domaine Cbd «Matériel et méthodes». Fig. 5. Profil d'éluti on du domai ne Cbd de CbpE purifié sur colonn e d'affin ité HisTra p. La purific ation du domai ne est réalisé e comm e indiqu é dans Grâce à la cellule spectrophotométrique, nous pouvons suivre la sortie des différentes protéines. On observe une claire distinction entre deux zones dans le graphique. La première (1) correspond surtout à la sortie de toutes les protéines qui ne se sont pas accrochées à la colonne, car elles n'avaient pas d'histidine dans leur séquence. Une fois toutes ces molécules sorties, on observe une nette descente de l'absorbance jusqu'au moment où le tampon B commence à passer à travers la colonne. Nous avons trois pics d'absorbance dans la zone (2) qui correspondent à la sortie de la protéine d'intérêt, soit le domaine Cbd de la CbpE. Comme expliqué précédemment, dans la partie «Principe des techniques», l'élution de la protéine peut se faire en utilisant le tampon B qui contient une forte concentration en Imidazole. Cette molécule a une très forte affinité pour les ions Ni 2+, elle entrera donc en compétition avec les histidines et finira par les décrocher. Les trois pics coïncident avec l'augmentation en pourcentage de tampon B. Le dernier équivaut donc au dernier palier, soit tampon B à 100 %. C est ici qu'on a l'absorbance la plus élevée de la

14 zone (2). Les fractions collectées que nous allons analyser par la suite, pour l'électrophorèse et la dialyse seront celles de la zone (2) du graphique. Plus spécifiquement, nous allons prendre celles qui correspondent aux pics et leurs alentours. Pic Fractions à étudier 1 12, 14, , 23, 25, 27, , 33, Analyse électrophorétique de la purification du domaine Cbd Fig. 6. Détermination des fractions à utiliser pour la dialyse du domaine Cbd par électrophorèse SDS-PAGE. Les fractions déposées ont été mises entre parenthèse. Puits 1 : Témoins de masse moléculaire réduits Puits 2 à 12 : 12 µl de chaque fraction choisie plus 4 µl de tampon laemmli 4X Puits 13 : 12 µl d extrait protéique avant passage sur la colonne Tout d abord, il faut remarquer que tous les puits où l on a déposé les fractions collectées, contiennent plusieurs bandes et que ces bandes sont aussi observables dans l extrait protéique (puits 13). C est un résultat inattendu, car il n aurait dû y avoir qu une seule bande correspondant au domaine Cbd. Plusieurs hypothèses peuvent être proposées sur la nature des bandes de plus faible PM : Des protéases ont pu être libérées lors de la lyse bactérienne et dégrader le domaine Cbd et ceux, malgré la présence d anti-protéases Il est aussi possible que la colonne HisTrap soit contaminée, car elle n a pas été régénérée juste avant son utilisation. De ce fait, on peut avoir des contaminants dans nos solutions de protéine.

15 3.1.3 Chromatographie d affinité du domaine catalytique de Pce é dans «Matériel et méthodes». Fig. 7. Profil d'éluti on du domai ne catalyt ique Pce purifié sur colonn e d'affin ité HisTra p. La purific ation du domai ne est réalisé e comm e indiqu De la même façon que pour l'élution du domaine Cbd, nous observons ici deux zones distinctes. La première (1) correspondant à la sortie de toutes les protéines qui contaminaient notre échantillon. Et la deuxième (2) qui équivaut donc à la sortie du domaine catalytique de la CbpE. Trois pics sont également présents dans la zone (2), et correspondent au passage du tampon B sur la colonne. A la différence de la fig. 5., ce profil d'élution montre des pics de très faible hauteur. Le dernier pic est certainement celui qui contient la plus grande quantité de protéine. Les fractions suivantes ont été sélectionnées pour l'analyse par électrophorèse. Pic Fractions à étudier 1 12, 14, , 24, 26, 28, , Analyse électrophorétique de la purification du domaine catalytique

16 Fig. 8. Détermination des fractions à utiliser pour la dialyse du domaine catalytique par électrophorèse SDS-PAGE. Les fractions déposées ont été mises entre parenthèse. Puits 1 : Témoins de masse moléculaire réduits Puits 2 à 11 : 12 µl de chaque fraction choisie plus 4 µl de de tampon laemmli 4X Puits 12 : 12 µl d extrait protéique avant passage sur la colonne A la différence de l électrophorèse du domaine Cbd, celle-ci montre des fractions où le domaine catalytique a bien été purifié (on ne voit qu une seule bande par puits). Ces fractions seront parfaitement exploitables pour faire la dialyse. Les fractions que nous allons prendre sont celles où la bande correspond à un poids moléculaire équivalent à celui du domaine Pce (PM = ,2 g/mol). La bande doit aussi apparaître avec une bonne épaisseur. Les fractions choisies sont donc celles qui correspondent aux trois derniers puits, c est-à-dire les fractions Elimination de l Imidazole par dialyse Après avoir suivi le protocole de la dialyse, il est nécessaire de mesurer l absorbance des solutions de protéine. Ceci dans l objectif de savoir si l on a perdu de la protéine lors de ce procédé et de connaître la concentration exacte avec laquelle on travaillera par la suite. Données : ε Pce = l.mol -1.cm -1 MM Pce = ,2 g.mol -1 L = 1 cm ε : Coefficient d extinction molaire L : longueur de la cuve spectrophotométrique DO 280 avant dialyse DO 280 après dialyse Concentration domaine Pce 0,136 0,050 0,033 µg/µl Calcul :

17 c= A 050 MM =0, 37954,2=0, 033 g /l ε L c=0, 033 µg /µl Les résultats obtenus ne pourront malheureusement pas être exploitables. Une concentration aussi faible de 0,033 µg/µl ne nous permettra pas de faire les tests ELISA. Il est évident qu il y a eu une grande perte de protéine lors de la dialyse. Il faudra en faire une nouvelle avec le matériel restant et des paramètres différents. On pourrait par exemple utiliser un nouveau tampon, tel que le PBS 1X et voir comment le domaine catalytique se comporte dans ces nouvelles conditions. 3.3 Analyse des interactions entre la ficoline L et le domaine catalytique Pce par ELISA Dans un premier temps, des concentrations croissantes du domaine catalytique Pce de la protéine CbpE ont été immobilisées sur la microplaque. L analyse de l interaction de la ficoline L avec ce domaine montre une interaction dose-dépendante. Fig. 9 : Fixation de la ficoline L sur le domaine catalytique Pce, évaluée par test ELISA. Le test ELISA est réalisé comme indiqué dans «Matériel et méthodes». Ces résultats nécessitent d être confirmés car l expérience a été réalisée avec du domaine catalytique non dialysé. La présence d imidazole pourrait avoir un effet sur l interaction, même si ce dernier contaminant a normalement été éliminé durant les premières étapes du test ELISA.

18 III CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES La choline binding protein E est une protéine de surface de certaines souches de pneumocoques. Elle joue un rôle principal dans les processus d infection de ces microorganismes. Il est donc très intéressant d étudier la structure et la fonction de cette protéine. Au cours du stage, nous avons essayé de purifier les deux domaines les plus importants de la CbpE pour analyser ensuite les interactions avec la ficoline L. Il faut remarquer que la purification des domaines Cbd et Pce n a pas été très facile à faire. Tout d abord, l analyse par électrophorèse des fractions collectées par chromatographie d affinité du domaine Cbd a montré qu il y avait eu soit protéolyse, soit contamination. Il a été proposé de faire une analyse par western blot pour savoir avec exactitude si les bandes majoritaires correspondaient effectivement au domaine Cbd. Le cas échéant, les fractions seraient exploitables pour continuer l expérience. Il pourrait aussi être intéressant de faire une deuxième purification par chromatographie d affinité sur colonne HisTrap, car normalement la seule protéine possédant un tag histidine est le domaine Cbd. D un autre côté, le domaine catalytique n a pas présenté de problème de séparation lors de la chromatographie d affinité, mais au moment de la dialyse. Des expériences précédentes avaient déjà montré que la protéine entière CbpE n était pas très stable et avait tendance à précipiter lors de la dialyse. Il semblerait que ce domaine pose les mêmes problèmes, car les mesures d absorbance ont révélé une perte nette de protéine après dialyse. Deux solutions ont été envisagées: Etant donné que le contaminant que l on veut éliminer est l Imidazole et qu il est très probable qu il n intervienne pas dans les prochaines étapes, on pourrait essayer de faire les tests ELISA sans passer par la dialyse. On pourrait aussi faire une nouvelle dialyse dans un autre tampon où la protéine serait plus stable. Ce qui éviterait la précipitation. Le laboratoire prévoit d étudier les interactions entre la ficoline L et d autres constituants de la paroi des pneumocoques : les LTA et TA, dont les structures comportent également des molécules de Pcho.

19 APPRECIATIONS PERSONNELLES Stage au sein du groupe IRPAS Je dois dire que cette expérience n'a été que productive. Travailler au sein de ce groupe m'a permis de découvrir la vie d'un scientifique et d'acquérir certaines caractéristiques et gestes nécessaires pour le bon déroulement des expériences. Les personnes qui composent l'irpas m'ont appris de nombreuses techniques et m'ont donné l'opportunité de me captiver avec la science. Ils avaient tous l'esprit des professeurs, toujours à vouloir m'enseigner et m'expliquer tout ce qui se passait autour de moi. En outre, ce stage m'a permis de participer à des conférences, des colloques, des journées scientifiques et des soutenances de thèse. Ce qui, de toute évidence, développe mes connaissances et me fait entrer davantage dans le monde de la science et la recherche. Dispositif des stages d excellence Cela me paraît très gratifiant qu'un tel dispositif soit proposé par l'université. J'ai parlé à beaucoup de personnes durant mon stage et ils me disaient que pouvoir passer au moins un mois dans un laboratoire de recherche, dès la première année d'études, était une opportunité unique. Dans un milieu si pluridisciplinaire tel que la recherche en biologie, il est indispensable de pouvoir s imprégner et de connaître chaque spécialité : l'immunologie, les neurosciences, la microbiologie, la physiologie, la génétique, entre autres. Dans le but de bien construire son propre parcours. Pouvoir réaliser de nombreux stages est ainsi l'une des meilleures façons de s'immerger dans cet environnement. Juste une remarque sur l'organisation du site Internet. Peu après avoir commencé mon stage, j'ai parlé à d'autres étudiants et ils croyaient qu'il y avait toujours des stages proposés, car la mention «pourvu» n'apparaissait pas en face d'eux. De ce fait, ils envoyaient des mails pour l'obtention de ceux-ci, après quoi ils recevaient des réponses négatives. A part cela, je n'ai que des propos positifs sur le dispositif. J'espère qu'il continuera d'exister car cela pousse les étudiants, désireux d'entrer dans le monde de la recherche, à exceller académiquement.

20 BIBLIOGRAPHIE C. Attali et al. Streptococcus pneumoniae Choline-binding Protein E Interaction with Plasminogen/Plasmin Stimulates Migration across the Extracellular Matrix. Infection and Immunity. 2008, 76, 2, C. Frolet et al. New adhesin functions of surface-exposed pneumococcal proteins. BMC Microbiology 2010, 10, F. Teillet. Caractérisation fonctionnelle et structurale de la protéase MASP-3 associée à la MBL et aux ficoline. Université joseph fourier, spécialité biologie. Laboratoire d enzymologie moléculaire de l IBS G. Garau et al. Crystal Structure of Phosphorylcholine Esterase Domain of the Virulence Factor Choline-binding Protein E from Streptococcus pneumoniae. The Journal of Biological Chemistry. 2005, 280, 31, M. Lacroix et al. Residue Lys57 in the Collagen-Like Region of Human L-Ficolin and Its Counterpart Lys47 in H-Ficolin Play a Key Role in the Interaction with the Mannan-Binding Lectin-Associated Serine Proteases and the Collectin Receptor Calreticulin. The Journal of Immunology, 2009,182, N.M. Thielens. Ficolins : innate immune recognition proteins for danger sensing. Inmunología. 2007, 26, 3, S. Bergmann, S. Hammerschmidt. «Versatility of pneumococcal surface proteins». Microbiology's Mini-Revew. 2006, 152, V. Garlatti. Systèmes effecteurs de l immunité innée : reconnaissance et voies de signalisation. Etude structurale des propriétés de reconnaissance des ficolines et du C1q. Etude cellulaire du role de la protéine ELMO 1 dans l élimination des cellules apoptotiques. UJF. Spécialité Biologie Structurale et nanobiologie. Thèse présentée à l IBS Bio.net. Les ligands peptidiques radioactifs et fluorescents. Biologie et Recherche. Consulté le 29/05/2012. <http://www.123bio.net/cours/liaison/partie21.html >. B. Leblanc. La purification des protéines. Biochimie des protéines. 15/07/2011. Consulté le 01/06/2012. <http://pages.usherbrooke.ca/bcm-514-bl/5e1.html >. P. Bobillo. Résonance plasmonique de surface. Biochimie structurale et fonctionnelle. Consulté le 29/05/2012. <http://www.restice.univ-montp2.fr/bsfdun/co/resonplasmonique.html >.

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