Les Biopeptides. On désigne par le terme biopeptide un peptide potentiellement actifs.

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1 Procédés enzymatiques de production de fractions peptidiques enrichis en peptides bioactifs Identification et caractérisation de peptides antioxydants, antihypertensifs et antithrombiques NASRI Moncef, BOUGATEF Ali, BALTI Rafik, NASRI Rim, NEDJAR- ARROUME Naïma, GUILLOCHON Didier, DHULSTER Pascal Laboratoire de Génie Enzymatique et de Microbiologie (LGEM) ENIS TUNISIE Laboratoire de Procédés Biologiques Génie Enzymatique et Microbiens (ProBioGEM), Lille FRANCE

2 Les Biopeptides Que sont les Biopeptides? On désigne par le terme biopeptide un peptide potentiellement actifs. Génération de Biopeptides Les Biopeptides présents à l état latent dans la séquence des protéines peuvent être libérés par hydrolyse : * Au cours du processus physiologique de digestion, * Au cours de la Fermentation, * Par protéolyse contrôlée en réacteur enzymatique Les protéines de poisson sources potentielles de peptides biologiquement actifs 2

3 Les Biopeptides Peptides Matières bioactifs protéiques Animale Collagène Caséine hémoglobine Déchets de poissons Antihypertensif Antithrombotique Immunomodulant Antimicrobien Végétale Soja Gluten de blé Germe de blé Antioxydant 3

4 Les Biopeptides Système cardiovasculaire Système nerveux Système digestif Système immunitaire Hypocholestérolémiant Anxiolique Secretagogue Immunomodulant Antioxydant Anti thrombotique Hypotenseur Satietogène Agoniste opiacé antagoniste opiacé antimicrobien 4

5 Démarche Scientifique pour l obtention de peptides actifs Poisson ou Coproduits de poissons Cuisson 100 C ; 20 min Homogénéisation Hydrolyse enzymatique Centrifugation 5000 g 20 min Surnageant Lyophilisation Lyophilisation RP-HPLC Spectrométrie de masse (ESI) Spectrométrie de masse en tandem «ESI/MS/MS» Gel filtration G-25 Ultrafiltration (UF) Peptides bioactifs 5

6 Les peptides antihypertensifs d hydrolysats protéiques de muscle de la seiche commune (Sepia officinalis). Purification et identification 6

7 7

8 Conditions d hydrolyse 8

9 Cinétique d hydrolyse 18,7% 15% 5% DH maximum : Protéases de A21 DH minimum : Protéases de ES1 9

10 L hydrolysat prépar paré par les protéases de A21 a l activitl activité inhibitrice la plus élev levée 10

11 A Optimisation de la protéolyse B DH = 16% DH = 8% Protéases de A21 Extrait endogène de seiche 11

12 Gel Filtration G-25G 12

13 RP-HPLC 13

14 Séquences de peptides antihypertensifs Fractions MM (Da) Séquences CI 50 (µm) P ,3 Gly-His-Gly 122,0 P ,1 Gly-Asp-Ala-Pro 22,5 P ,1 Ala-Gly-Ser 527,9 P ,0 Ala-Gly-Ser-Ser 672,1 P ,1 Ala-His-Ser-Tyr 11,6 P ,2 Ala-Gly-Ser-Pro 37,2 P ,1 Gly-Val-His-His-Ala 71,8 P ,0 Asp-Phe-Gly 44,7 P ,0 Phe-Gly-Gly 82,5 P ,2 Ala-Val-Val 66,6 P ,1 Ile-Ala-Val 153,4 F ,2 Met-Ala-Trp 16,32 F ,2 Val-Tyr-Ala-Pro 6,1 F ,1 Val-Ile-Ile-Phe 8,7 14

15 Stabilité vis-à-vis des protéases gastrointestinales Enzyme Inhibition de l ECA (%) Ala-His-Ser-Tyr Met-Ala-Trp Val-Tyr-Ala-Pro Val-Ile-Ile-Phe Contrôle Pepsine Trypsine 99, Chymotrypsine 98, Pepsine + Trypsine + Chymotrypsine 98,

16 Activité antihypertensive in Vivo sur des rats hypertendus 10 Val-Tyr-Ala-Pro Varaiation SBP (mmhg) Eau 0,1 mg/kg 1 mg/kg 10 mg/kg Captopril Temps (heure) 10 Ala-His-Ser-Tyr 10 Met-Ala-Trp V a ria tio n S B P (m m H g ) Eau 0,1 mg/kg 1 mg/kg 10 mg/kg Captopril V ariation S B P (m m H g) Eau 0,1 mg/kg 1 mg/kg 10 mg/kg Captopril Temps (h) Temps (h) 16

17 Les peptides antioxydants d hydrolysats protéiques de muscle de sardine (Sardina pilchardus). Purification et identification 17

18 Que sont les antioxydants? Les Antioxydants sont des substances chimiques, qui ajoutées à faibles doses, à un produit naturellement oxydable à l air, sont capables de diminuer ou d empêcher l oxydation de substances chimiques. Les antioxydants de synthèse Hydroxyanisole butylé (BHA) Les différents types d antioxydants Les antioxydants naturels Les antioxydants enzymatiques : Superoxyde dismutase, catalase, etc. Les antioxydants d origine alimentaire : Acide ascorbique (Vitamine C), le tocophérol (Vitamine E), les polyphénols, etc. Les peptides antioxydants. 18

19 12 10 H2 8 DH (%) 6 H1 H H3 Protéases NH1 Extrait endogène de sardine Alcalase Protéases ES Temps(min) Alcalase : H1 Protéases NH1 : H2 Protéases ES1 : H3 Extrait de sardine : H4 19

20 100 3 Activité antiradicalaire (%) A700 2,5 2 1,5 1 0,5 0 BHA H1 H2 H3 H4 0 BHA H1 H2 H3 H4 Absorbance 500 nm Inhibition (%) Contrôle 2,65 ± 0,02 0 H1 1,75 ± 0,01 33,96 ± 0,6 H2 1,85 ± 0,01 30,18 ± 0,52 H3 2,25 ± 0, ± 0,3 H4 1,28 ± 0,012 51,69 ± 0,42 α-tocophérol 0,6 ± 0,01 77,35 ± 0,11 20

21 21

22 Les Biopeptides Fractions MM (Da) Séquences DPPH (%) F1 471,3 Leu-Ala-Arg-Leu 51 F2 263,08 Gly-Gly-Glu 38 F3 431,2 Leu-His-Tyr 63 F4 283,1 403,1 528,2 Gly-Ala-His Gly-Ala-Trp-Ala Pro-His-Tyr-Leu F5 538,2 Gly-Ala-Leu-Ala-Ala-His

23 Peptides antithrombiques Caractérisation d activité antithrombique dans les hydrolysats protéiques des produits de la pêche Purification et identification 23

24 Les peptides antithrombiques Hémostatse : processus physiologique qui permet d'interrompre le saignement pour éviter l'hémorragie Voie extrinsèque Voie intrinsèque Caillot de sang 24

25 Cibles des traitements anti thrombotiques et thrombolytiques Traitement anti-thrombotique Anticoagulants Antiplaquettaires * Synthèse des facteurs pro-coagulants (ex. AVK) * Activité des facteurs coagulants type thrombine et facteur Xa (ex. Héparine) Traitement thrombolytique ou fibrinolytique Plasminogène Plasmine 1 iére génération : streptokinase, urokinase 2 ième génération: rtpa Enzymes fibrinolytiques d origine bactériennes Nattokinase de B. subtilis natto Hydrolyser le caillot de fibrine Active le plasminogène en plasmine Augmente la production de tpa 25

26 Les peptides antithrombiques Les pathologies cardiovasculaires sont traitées aux moyens : d agents anticoagulants et antithrombiques (héparine, aspirine, etc.) qui préviennent l extension et la récurrence de la thrombose, D agents thrombolytiques - Activateurs du plasminogène :Urokinase, Streptokinase, tpa - Enzymes plamine-like, appelées enzymes fibrinolytiques T BAF1 BSF1 (1000 U) NK (1000 U) 26

27 Les peptides antithrombiques Les peptides antithrombiques d hydrolysats protéiques de muscle de Gobie (Zosterisessor ophiocephalus). Purification et identification 27

28 Activité Antithrombique E/S = 3 28

29 Activité Antithrombique Le temps de céphaline + activateur (TCA) L hydrolysat protéique prépar paré avec la préparation paration de NH1 a l activitl activité inhibitrice la plus importante de la voie intrinsèque de la coagulation 29

30 Activité Antithrombique E/S = 3 40 mg/ml DH= 8.86 Protéases de NH1 30

31 Activité Antithrombique 31

32 Publications Balti R, Nedjar-Arroume N, Yaba Adjé E, Guillochon D and Nasri M (2010). Analysis of novel angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides from enzymatic hydrolysates of Cuttlefish (Sepia officinalis) muscle proteins. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58, Balti R, Nedjar-Arroume N, Bougatef A, Guillochon D and Nasri M (2010). Three novel angiotensin I- converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from cuttlefish (Sepia officinalis) using digestive proteases. Food Research International, 43, Balti R, Bougatef A, Souissi N, El-Hadj Ali N, Zekri D, Barkia A and Nasri M (2010). Influence of enzymatic hydrolysis extent on the functional properties and angiotensin I converting enzyme inhibitory activity of protein hydrolysates from Cuttlefish (Sepia officinalis) by products. Journal of the Science of Food and Agriculture, (In press). Barkia A, Bougatef A, Ben khaled H et Nasri M (2009). Antioxidant activities of sardinelle heads and/or viscera protein hydrolysates prepared by enzymatic treatment. Journal of Food Biochemistry,

33 Publications Bougatef A, Hajji M, Balti R, Lassoued I, Triki-Ellouze Y et Nasri M (2009). Antioxidant and free radical-scavenging activities of smooth hound (Mustelus mustelus) muscle protein hydrolysates obtained by gastrointestinal proteases. Food Chemistry, 114, Bougatef A, Nedjar-Arroume, Manni L, Ravalec-Ple, R, Guillochon D, Barkia A, et Nasri M (2009). Purification and identification of novel antioxidant peptides from enzymatic hydrolysates of sardinelle (Sardinella aurita) by-products proteins. Food Chemistry, Bougatef A, Nedjar-Arroume N, Ravalec-Ple R, Lassoued I, Barkia A, Estelle Yaba, Guillochon D et Nasri M (2009). Evaluation of angiotensine-i converting enzyme (ACE) inhibitory activities of smooth hound (Mustelus mustelus) protein hydrolysates generated by gastrointestinal proteases. European Food Research and Technology, 231, Bougatef A, Ravalec-Ple, Nedjar-Arroume, R, Guillochon D, Barkia A, et Nasri M (2009). Evidence of in vivo satietogen effect and control of food intake of smooth hound (Mustelus mustelus) muscle protein hydrolysate in rats. Journal of Functional Foods, 2,

34 Brevet 1: Peptides antioxydants à partir d hydrolysats protéiques de têtes et viscères de sardinelle (Sardinella aurita) Isolement et identification Bougatef A, Nedjar-Arroume N, Manni L, Ravalec-Ple R, Guillochon D, Barkia A, et Nasri M (2008). Brevet 2: Procédé de production d hydrolysats de protéines de muscle de la seiche commune (Sepia officinalis) enrichis en peptides antihypertensifs. Purification et identification de 14 biopeptides. Balti R, Nedjar-Arroume N, Bougatef A, Guillochon D, Barkia A, et Nasri M (2010). 34

35 35

36 Les peptides antithrombiques 1. Vasoconstriction Hémostase processus physiologique qui permet d'interrompre le saignement pour éviter l'hémorragie 2. Hémostase primaire 3. Coagulation plasmatique 4. fibrinolyse 36

37 TRYPSINES MARBRE BALISTE SEICHE Espèce Organe MW ph T ( C) N-terminale Référence Sardine Viscères IVGGYECQKYSQ Bougatef et al. (2007) Sardinelle Viscères IVGGYECQKY IVGGYEAQSY IVGGYEAQSY Ben Khedl et al. (2010) Bogue Viscères Barkia et al. (2010) Marbre Viscères El Hadj ali et al. (2010) Baliste Intestin IVGGYECTPNST Jellouli et al. (2009) Seiche Hépatopancréas IVGGKESSPYNQ Balti et al. (2009) Emissole lisse Intestin IVGGYECKPHSQ Bougatef et al. (2010) BOGUE EMISSOLE LISSE SARDINE SARDINELLE 37

38 Gel Filtration G-25 Le pool F 5 présente la meilleure activité inhibitrice de l ECAl 38

39 Activité antihypertensive in Vivo sur des rats hypertendus 39

40 Peptides antioxydants Oxydation Radicaux libres Instables et très réactifs r ADN, protéines, lipides membranaires Maladies 40

41 Les Biopeptides 41

42 Séquences de peptides antihypertensifs Fractions MM (Da) Séquences CI 50 (µm) F ,2 Met-Ala-Trp 16,32 F ,2 Val-Tyr-Ala-Pro 6,1 F ,1 Val-Ile-Ile-Phe 8,7 42

43 Séquences de peptides antihypertensifs Fractions MM (Da) Séquences CI 50 (µm) P ,3 Gly-His-Gly 122,0 P ,1 Gly-Asp-Ala-Pro 22,5 P ,1 Ala-Gly-Ser 527,9 P ,0 Ala-Gly-Ser-Ser 672,1 P ,1 Ala-His-Ser-Tyr 11,6 P ,2 Ala-Gly-Ser-Pro 37,2 P ,1 Gly-Val-His-His-Ala 71,8 P ,0 Asp-Phe-Gly 44,7 P ,0 Phe-Gly-Gly 82,5 P ,2 Ala-Val-Val 66,6 P ,1 Ile-Ala-Val 153,4 43

44 L hydrolysat obtenu par l extrait enzymatique de viscères de sardine (H4) présente le pouvoir d inhibition le plus important de l oxydation de l acide linoléique (51,69%). 44

45 Responsable du LGEM Pr. Moncef Nasri Les Unités Biotechnologie Marine Génie Enzymatique Biologie Moléculaire Biotechnologie Microbienne Farines de poissons Peptones de poissons Protéases endogène de poissons Biopeptides Screening de souches protéolytiques Isolement et purification de protéases Évaluation des protéases dans la détergence Isolement des gènes codant pour les protéases d intérêt Clonage et expression des gènes codant pour les protéases d intérêt Enzymes fibrinolytiques Protéases fongiques Valorisation des tubercules de belle de nuit Substances bioactives Valorisation des plumes de volailles 4 5