A-t-on besoin de la biologie moléculaire en mycologie hospitalière?

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1 A-t-on besoin de la biologie moléculaire en mycologie hospitalière? Stéphane Bretagne Hôpital Henri Mondor, Créteil CNR Mycologie Antifongiques, Institut Pasteur, Paris

2 Questions Diagnostic positif Génotypage Identification Aspergilloses invasives Candidoses invasives «Emergents»

3 Diagnostic positif

4 Diagnostic microbiologique des infections fongiques Peu sensibles (< 50%) Interprétation? Véritable infection? Colonisation? Contamination? Tardif Mortalité de l aspergillose invasive : 70-90% Mortalité des candidémies : 50 % Une solution: la PCR LBA sérum

5 PCR Aspergillus LBA Jusqu à 35% de PCR+ (Spreadbury C. JCM 1993; Tang CM, Am Rev Resp Dis 1993; Verweij P. JCM 1994; Bretagne S. JCM 1995, Skladny R. JCM ) Confirmation de cultures positives Conidies en transit? Colonisaton? Infection? 5% de PCR + (Einsele H. Lancet 1998) 134 patients sous flux, LBA avant greffe 7/134 PCR+ 5 des 7 PCR+ développent une aspergillose 3 des PCR- développent une aspergillose

6 PCR sérum Hebart et al JID patients greffés de moelle sous flux 169/1193 PCR + 37,5% (30/84) patients PCR+ avant J40 et 40% (12/30) après J40 7 aspergilloses prouvées Sensibilité: 100% Spécificité: 65% VPP: 15,2% VPN: 100%

7 Comment expliquer ces résultats? Faux + et faux - Manque de standardisation Pas d intérêt commercial Méthodes artisanales Différences dues: A la méthode employée? Aux populations testées?

8 Comment expliquer ces résultats divergents? Germes de l environnement On trouve de l ADN fongique partout Stratégie Panfungus? Ciblé sur des germes d intérêt?

9 Comment avancer? Standardiser les méthodes de PCR Associer plusieurs tests de finalités différentes Comparaison Ag-ADN Recherche d ARN

10 Standardisation des techniques PCR en temps réel Sondes d hydrolyse «Taqman» Sondes d hybridation «FRET» NASBA ARN ADN

11 PCR en temps réel - Prévention des contaminations -

12 NASBA - détection d ARN -

13 Comparaison de différents tests PCR quantitative vs GM vs ß-D-Glucan Criblage hebdomadaire des sérums 149 épisodes, 96 patients d hématologie 9 prouvées, 2 probables, 13 possibles (critères EORTC) Kawazu M, et al, JCM, 2004

14 Comparaison des différents tests méthode sensibilité spécificité PPV NPV GM 1,00 0,93 0,55 1,00 qpcr 0,55 0,93 0,40 0,96 ß-D- Glucan 0,55 0,93 0,40 0,96 Kawazu M, et al, JCM, 2004

15 NASBA + GM 448 sérums de 128 patients 14 patients avec IA (2 prouvées, 12 probables) Sensibilité (NASBA >5 + GM> 0,5) = 100% Valeur pronostique des index NASBA Pb: ARNs extraits de tube EDTA Yoo J-H, CID 2005

16 Seuil détection PCR Candida Cible ARNr détection Sensibilité CFU/ml référence 5S Br. 15 Holmes, JCM 94 éthidium 5,8S EIA 10 Fujita, JCM 95 18S van Deventer, JCM 95 Souhernblot 18S Souhernblot Polanco, EJCMID 95 18S ELISA 10 Loffler, Med Mycol, 98

17 PCR Candida Difficultés à concurrencer les automates à hémocultures Détection d ADN répété potentiellement plus sensible que les hémocultures mais signification?

18 Diagnostic Standardisation des méthodes de détection Standardisation des méthodes d extraction Association de tests de finalité différente

19 Typage moléculaire

20 Pourquoi disposer d un système de génotypage? Génétique Populations Reproduction clonale Sexualité Epidémiologie clinique Transmission nosocomiale Investigation d épidémies Isolats pathogènes versus non pathogènes Correspondance génotype-phénotype (résistance aux antifongiques, variation des génotypes sous pression médicamenteuses) Physiopathologie d une infection (même isolat ou contamination avec un nouveau)

21 Caryotype A. nidulans H. Brody, PNAS 1989

22 RFLP + hybridation: différentes étapes pour informatiser les données expérimentales Soll DR Clin Microbiol Rev 2000

23 RAPD C. albicans Soll DR Clin Microbiol Rev 2000

24 MLST (multilocus sequence typing) ME Bougnoux et al, JCM 2002

25 Microsatellites Short tandem repeats: motifs de 2-6 nucléotides Polymorphes et nombreux (Weber, Genomics 1990) Présents chez les eucaryotes inférieurs, e.g. Candida albicans (Field et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996; Bretagne et al., Clin. Microbiol. 1997) et Aspergillus fumigatus Analyse par PCR et séquenceur automatique

26 Microsatellite parfait Figure 1 Allele 1 (122bp) Allele 2 (128bp) Allele 3 (134bp) Allele 4 (140bp) Allele 5 (146bp) TTAGCATTAGCATTAGC [ACAAGC] 4 TTTATAA TTAGCATTAGCATTAGC [ACAAGC] 5 TTTATAA TTAGCATTAGCATTAGC [ACAAGC] 6 TTTATAA TTAGCATTAGCATTAGC [ACAAGC] 7 TTTATAA TTAGCATTAGCATTAGC [ACAAGC] 8 TTTATAA Gène RPM2 C. glabrata (F. Foulet, JCM accepté)

27 Microsatellite: analyse des produits de PCR d A. fumigatus

28 Analyse des microsatellites d isolats d Aspergillus fumigatus Isolat 1 Isolat 2 Isolat 3

29 Microsatellite: analyse des produits de PCR de C. albicans C. albicans : 2 allèles C. albicans : homozygote

30 Applications du génotypage: Question: Infection nosocomiale ou non? Deux exemples Aspergillus fumigatus Candida albicans

31 A : 80 / 93 16/18 8/8 13/15 13 / / / 17 21/ 22 9 / 9 9 / 9 14 / 14 Outpatient Clinic : 74 / m Garden 56 / 61 5 / 5 18 / / 11 8 / 9 15 / / / / 10 6 / 7 13 / 13 8 / 8 M : 78 / 89 4 / 4 Hôtel-Dieu, Paris 6 / 6 7 / 10 G : 16 / 20 Hematology Unit Institut Pasteur, Laboratoire des Aspergillus Debeaupuis JP et al, Inf Immun 1997

32 25 Number of isolates Number of months Institut Pasteur, Laboratoire des Aspergillus Debeaupuis JP et al, Inf Immun 1997

33 E P E 1.1 Isolates environmental -3 2 environmental 1 clinical 2 clinical ref. strain Répartition des génotypesg en fonction de l originel clinique ou environnementale P Bart-Delabesse et al, JCM 1998

34 Pt 9-I Pt 12-J Pt 18-H Pt 23-R B Pt 3-C Pt 6-FPt 7-GPt 10-I Pt 11-E Pt 14-L* Pt 25-T* Pt 24-S B3 Pt 1-A Pt 8-H Pt 19-P Pt 21-H Pt 24-S* Pt 26-U Pt 22-Q Pt 29-W* Pt 27-I Pt 30-X Pt 21-H B2 Pt 15-M* Pt 2-B Pt 4-D* Pt 5-E Pt 16-N Pt 13-K Pt 17-O Pt 20-I Pt 25 Pt 28-V B1 November December January February March April May June July August September October November Stéphan et al CID 2002

35 Conclusion génotypage Nombreuses techniques possibles Définir sa question Une technique donnée ne répondra pas à toutes les questions

36 Identification

37 Filaments dans une biopsie?

38 Diagnostic des mucormycoses

39 Identification Cultures difficiles de certains champignons Extraction d ADN de biopsies Amplification, séquençage Comparaison aux banques de données

40 A-t-on besoin de la biologie moléculaire en mycologie hospitalière? OUI Domaine en plein développement Intérêt certain pour une meilleure prise en charge des patients

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