Research Collection. Priming RNA silencing with chemicals: a new strategy to achieve plant resistance to pathogens. Doctoral Thesis.

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1 Research Collection Doctoral Thesis Priming RNA silencing with chemicals: a new strategy to achieve plant resistance to pathogens Author(s): Jay-Brioudes, Florence Publication Date: 2016 Permanent Link: This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information please consult the Terms of use. ETH Library

2 DISS. ETH NO PRIMING RNA SILENCING WITH CHEMICALS: A NEW STRATEGY TO ACHIEVE PLANT RESISTANCE TO PATHOGENS A thesis submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH (Dr. Sc. ETH Zurich) presented by FLORENCE JAY-BRIOUDES M. Sc., Université de Pau et des Pays de l Adour Pau, France Born on Citizen of France Accepted on the recommendation of: Prof Dr. Olivier Voinnet, examiner Prof. Dr. Hervé Vanderschuren, co-examiner Dr. Stéphane BLANC, co-examiner 2016

3 Abstract RNA silencing collectively refers to sequence-specific inhibition of gene expression by small non-coding RNAs. Accumulating results have now established key roles for RNA silencing in plant defense responses against a wide array of pathogens that are responsible for important yield losses both in developed and emerging countries, directly conflicting with the ever-increasing demand for food. RNA silencing is first a potent antiviral mechanism whereby small interfering RNAs processed from viral double-stranded RNA replication intermediates by the enzyme Dicer are loaded into ARGONAUTE effector proteins and turned back onto the invader s genome to induce its degradation. More recent studies have also unraveled key roles for RNA silencing in regulating antifungal and antibacterial plant responses. Further emphasizing the importance of this mechanism in plant defenses, numerous pathogens have evolved various proteins to suppress RNA silencing, thereby enabling their efficient multiplication and systemic spread in their hosts. Taking into consideration these data, the present PhD project was aimed at priming RNA silencing as a new phyto-sanitary strategy to stimulate plants innate defense processes in anticipation of pathogen s attacks. Via the development of a medium-throughput screening procedure on Arabidopsis RNA silencing reporter lines, in collaboration with Bayer, chemical compounds that potently alter the RNA silencing pathway could be identified, and in particular compounds that enhance this mechanism in plants following the treatment. The best candidate compounds were validated on Arabidopsis plants grown on soil and their effects were analyzed at the molecular level by using state-of-the-art methodologies including real-time qrt-pcr, Northern and Western analyses. These analyses revealed that the candidate molecules affect distinct steps of RNA silencing. A strong in planta antiviral activity of some of the enhancers was further established by performing reproducible and quantitative infection assays with several distinct Arabidopsis-infecting viruses. Preliminary data also suggest a putative antibacterial effect of one of the molecules, which remains to be confirmed via further experiments. Altogether, our results provide the first proof-of-concept that priming RNA silencing with chemical treatments is a valid strategy to achieve plant resistance/tolerance to pathogens. 1

4 Résumé Le terme «RNA silencing», ou ARN interférent, fait référence à l inhibition de l expression de gènes dont la séquence nucléotidique est ciblée de manière spécifique par des petits ARNs non-codants. Actuellement, de nombreux résultats montrent que ce mécanisme joue des rôles clefs dans la réponse des plantes face à des pathogènes responsables d importantes baisses de rendements, dans les pays développés comme dans les pays émergeants, générant des pertes qui sont en conflit direct avec un besoin alimentaire toujours plus grand. A l origine, l ARN interférent possède un rôle antiviral conféré par la production de petits ARNs, par l enzyme Dicer, à partir d ARN double brins formés par des intermédiaires de réplication viraux. Ces petits ARNs sont pris en charge par les protéines effectrices ARGONAUTEs et peuvent alors cibler et induire la dégradation de l ARN viral envahisseur dont ils sont issus. Des études plus récentes ont aussi permis de découvrir des rôles clefs de l ARN interférent dans la régulation des réponses des plantes face aux champignons et aux bactéries. Attestant aussi de l importance de l ARN interférent dans les réponses de défense des plantes, certaines protéines de nombreux pathogènes ont acquis, au cours de l évolution, une activité de suppresseur de l ARN interférent, afin de permettre à ces organismes de se multiplier efficacement et de se propager dans la plante hôte. A partir de ces résultats, le projet de thèse présenté ici a pour but de démontrer que l ARN interférent peut être induit pour stimuler les processus de défense des plantes, dans l éventualité où celles-ci soient attaquées par des pathogènes. Des composés chimiques affectant la voie de l ARN interférent ont pu être identifiés grâce au développement, en collaboration avec Bayer, d une méthode de crible reposant sur l utilisation de lignées d Arabidopsis transgéniques rapporteuses de cette voie. Cette méthode a permis en particulier la découverte de composés capables de stimuler le processus d ARN interférent de la plante. Les composés les plus prometteurs ont été validés sur des plantes d Arabidopsis cultivées en sol, et leurs effets ont été analysés au niveau moléculaire grâce à des méthodes de RT-PCR quantitative, d analyse de certaines protéines par Western-blot et d ARN par Northern-bot. Les résultats ont révélé que ces molécules agissaient à différents niveaux du processus de l ARN interférent. Des tests d infection reproductibles et quantitatifs par différents virus capables d infecter Arabidopsis ont permis d établir une activité antivirale forte pour certaines des molécules ayant un effet stimulateur sur l ARN interférent. Des résultats préliminaires ont 3

5 également suggéré qu une des molécules testées induit une activité antibactérienne, ce qui devra toutefois être confirmé par des expériences complémentaires. Pour conclure, l ensemble de nos résultats a permis de démontrer que l induction de l ARN interférent par des traitements chimiques représente une nouvelle stratégie à fort potentiel pour aboutir à la résistance et/ou la tolérance des plantes contre les pathogènes. 4