«PRODUCTiON D insuline PAR LE PANCREAS»

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1 STAGE DE RECHERCHE «Tous chercheurs» Campus de Luminy Avril 2010 «PRODUCTiON D insuline PAR LE PANCREAS» Kévin Stéphane Pauline Meddy Emilie Rémy

2 Introduction L'insuline permet de réguler la glycémie. Si on admet que les cellules ß des îlots de Langherans du pancréas produisent de l'insuline, dans quelles conditions cette insuline est-elle produite? Quel signal permet aux cellules du pancréas de produire l'insuline? Afin de répondre à ces différentes questions, nous allons stimuler des cellules de pancréas et de rate avec du glucose à différentes concentrations pour ensuite détecter et doser l éventuelle production d insuline grâce au test E.L.I.S.A. Glucose Insuline

3 Stimulation des cellules à différents taux de glucose : On a mis en culture des cellules ß du pancréas (INS 1) et des cellules de la rate (CH27). Cellules INS 1 (x400) Cellules CH27 (x400)

4 Stimulation des cellules à différents taux de glucose : Cellules INS Cellule CH Nous avons versé dans les puits contenant les cellules de pancréas et dans les puits contenant les cellules de rate des solutions de glucose à différentes concentrations (mmol/l). Après 30 minutes d incubation à 37 C, on a prélevé les surnageants pour détecter et doser l insuline si elle a été produite. Pour cela, nous pratiquerons la méthode E.L.I.S.A

5 Principe test E.L.I.S.A : Le test E.L.I.S.A (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) est un test immunologique destiné à détecter et doser l insuline présente dans les surnageants issues des cellules stimulées par du glucose à différentes concentrations. 1ère étape: Fixation des anticorps anti-insuline dans les puits: Anticorps antiinsuline fixé dans le fond du puit Plaque E.L.I.S.A

6 2ème étape : Saturation On ajoute la solution de PBS/BSA, pour empêcher que l insuline se fixe sur les parois au lieu de se fixer sur les anticorps. 3ème étape : Fixation de l insuline sur les anticorps antiinsuline On a ajouté l insuline qui vient se fixer sur les anticorps antiinsuline.

7 4ème étape : Fixation de l anticorps anti-insuline couplé à l enzyme peroxydase. On a ajouté le deuxième anticorps anti-insuline conjugué à la peroxydase. 5ème étape : Ajout du substrat de la peroxydase (TMB) On a ajouté le substrat de la peroxydase. En se combinant avec l enzyme, on voit apparaître une coloration bleue.

8 6ème étape : Lecture de l absorbance La réaction chimique donne une couleur bleue, donc nous lirons l absorbance à la longueur d ondes correspondante (620 nm). Ensuite, on ajoute l acide chlorhydrique (HCl) pour stopper la réaction enzymatique. La coloration change et vire au jaune. Nous lirons donc ensuite l absorbance à la longueur d ondes correspondante cette fois à la couleur jaune (450 nm). Lecteur de plaques

9 NOTRE PROTOCOLE EXPERIMENTAL : A: Ligne de la courbe d étalonnage B:Ligne de la courbe d étalonnage D:Ligne témoin négatif E:Ligne de surnageant issue de cellules pancréatiques

10 Résultat du test E.L.I.S.A A D B E + HCl + HCl A D B E La ligne D correspond aux surnageants issues des cellules CH27 stimulées par différentes concentrations de glucose. La ligne E correspond aux surnageants issues des cellules INS-1 stimulées par différentes concentrations de glucose. On obtient un dégradé de couleurs : plus la concentration d insuline est élevée et plus la couleur sera foncée.

11 Etablissement de la gamme étalon

12 Concentration d insuline produite en fonction du taux de glucose: Cas des cellules CH27 (témoin négatif) Concentration d insuline ng/ml Concentration d insuline ng/ml Cas des cellules INS 1 Concentration glucose mmol/l Concentration glucose mmol/l

13 CONCLUSION D après les résultats que nous avons obtenus, nous pouvons conclure que, seules les cellules ß du pancréas (INS 1) sont capables de produire de l insuline. De plus, la quantité d insuline produite dépend de la concentration en glucose du milieu. Enfin, on peut supposer que la production d insuline par le pancréas ne nécessite pas l intervention d autres organes.

14 PERSPECTIVES On peut se demander si d autres sucres tels que le fructose, le saccharose ou l amidon peuvent déclencher la production d insuline. Peut-on produire de l insuline en synthèse? Est-il possible de produire de l insuline avec d autres cellules que celles du pancréas?