Plate-forme "Imagerie Puce à cellules"

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1 Plate-forme "Imagerie Puce à cellules" Cancéropôle Grand Ouest OUEST-genopole RNG Responsables : Rémy LE GUEVEL Christiane GUILLOUZO Denise GLAISE Tifenn LE CHARPENTIER Michel RAUCH Anne CORLU

2 Plate-forme "Imagerie Puce à cellules" Station d analyse cellulaire et de criblage haut débit pour : - Repérer et localiser une/ou un ensemble de fonctions cellulaires, - Caractériser et/ou évaluer l action biologique de molécules cibles sur cellules vivantes, in situ et en système organisé. Elle est ouverte à tous les laboratoires de OUEST-genopole, Cancéropôle Grand Ouest et accessible au Réseau National Genopoles.

3 Plate-forme "Imagerie Puce à cellules" La plate-forme est localisée dans un laboratoire L1 confiné et climatisé. Une salle est spécialement réservée pour l informatique. Principe de l organisation en parallèle pour le «haut débit» et de la micro et nanotechnologie, «Pour faire mieux, plus vite et moins cher»

4 Plate-forme "Imagerie Puce à cellules" Station d analyse cellulaire et de criblage haut débit GAMME DE SUPPORTS POUR CULTURES Culture en plaques «multiwells» demain : 1536 wells Culture en gouttes : nanodrop De 5 µl 100 nl (100 cellules) Culture en micro-puits : biochips puits 100 nl - 1 µl

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6 Plate-forme "Imagerie Puce à cellules" EQUIPEMENTS DÉDIÉS AUX TROIS ÉTAPES Distribution de cellules et de produits à haut débit Capture d images issues des tests biologiques Traitement "informatique" dédié avec logiciels d analyses d images

7 I- Ensemencement : spotter robotisé Transfert de cellules vivantes Vitesse d éjection des gouttes réglable entre 2 et 5 milli-sec Volume minimal de dépôts inférieur à 200 pl, et volume maximal 1µl. 10 spots (chacun constitué de 10 gouttes) d affilée en 1 seconde Enceinte de protection avec contrôle de l humidité ambiante, permettant la culture de cellules

8 II - Microscope droit robotisé + caméra haute sensibilité + Système de roue à filtres à haute vitesse pour fluorescence à différentes longueurs d ondes permettant une combinaison de tests biologiques simultanés. Phase Hoechst Cyp 3A4 Phalloïdin

9 Plate-forme "Imagerie Puce à cellules" III - 3 postes "informatique" dédiés avec logiciels d analyses d images

10 Criblage de molécules Pour chaque molécule : - gammes de à 25 µm -triplicat - 24 et 48 heures de test - 4 photos moyennées - en plaques 96 puits Total capture de : 6912 images saisies et analysées en 12 heures

11 Exemple 1 Analyse d une population cellulaire hétérogène Etude de noyaux

12 Exemple 2 Criblage de molécules Ensemble de molécules Cellules d origine tissulaire différentes Normales, transformées, très transformées Application à l étude d une série d inhibiteurs de kinases et de cycle cellulaire 10 lignées différentes Courbes de croissance et de mort cellulaire

13 Criblage de molécules inhibitrices ou activatrices de prolifération ou de mort au niveau cellulaire 1,4 1,4 1,2 1,2 1,2 1,0 1,0 1,0 0,8 fibroblastes de peau (cellules normales) Cellules % 0,8 0,6 0,4 0,2 A Cellules % 0,8 0,6 0,4 0,2 B Cellules % 0,6 0,4 0,2 C 0,0 0,001 0,01 0, µm 1,4 0,0 0,001 0,01 0, µm 1,4 0,0 0,001 0,01 0,1 µm ,4 1,2 1,2 1,2 1,0 1,0 1,0 hépatome HUH7 (cellules transformées) Cellules % 0,8 0,6 0,4 A Cellules % 0,8 0,6 0,4 B Cellules % 0,8 0,6 0,4 C 0,2 0,2 0,2 0,0 0,001 0,01 0, µm 1,4 0,0 0,001 0,01 0,1 µm ,4 0,0 0,001 0,01 0, µm 1,4 1,2 1,2 1,2 épithéliale biliaire F1 (cellules très transformées) Cellules % 1,0 0,8 0,6 0,4 A Cellules % 1,0 0,8 0,6 0,4 B Cellules % 1,0 0,8 0,6 0,4 C 0,2 0,2 0,2 0,0 0,001 0,01 0, µm 0,0 0,001 0,01 0, µm 0,0 0,001 0,01 0, µm Effet dose de 3 molécules (A, B, C) sur la prolifération de 3 types cellulaires. La courbe en rouge représente l effet d une molécule de référence. Valorisation des produits de la mer en cancérologie

14 Exemple 3 Tests metaboliques: approche par sirna Cycle cellulaire : blocage par sirna

15 Technique du TUNEL Controle - Marqueurs d apoptose Controle + (DNase) Apoptose induction (42 C)

16 Tests métaboliques : quantification de fonctions au niveau cellulaire et à l échelle individuelle L analyse d images reste complexe

17 Exemple 5 Effets comparés de substrats Cellules indifférenciées Cellules différenciées Cytosquelette : Phalloidin (F-actin)

18 Exemple 4 Tests métaboliques : "Metalab chip" TOXICITE DE MOLECULES - Pénétration (résistance) - Métabolisme- voies métaboliques - Effets cellulaires in situ - Clearance - Effets sur l environnement Y Autres types cellulaires par empreinte par contact A A B B Types cell.a et B Système intégré Y Y Puce +cell.y

19 Exemple 6 Tests métaboliques : identification systématique des sites actifs d une protéine et de leurs effets biologiques respectifs - Fractionnement en petits peptides ou séquences - Effets sur les organites et/ou fonctions cellulaires - Sur les composants du cytosquelette - Sur types cellulaires différents -

20 ENJEUX Académique : efficacité, robustesse, traçabilité Industriel : répondre aux besoins de la pharmacologie et toxicologie Rentrer dans les projets nationaux de l INCa Répondre aux besoins des Industriels européens de la chimie : projet REACH

21 Règles d'accessibilité Etude de faisabilité du projet avec les responsables de la plate-forme Définition de la démarche expérimentale Prise en charge du spotting des cellules et des molécules, du suivi des cultures et des tests biologiques par les ingénieurs de la plate-forme Pour les tests à haut débit, la plate-forme assure la saisie et l analyse d images ainsi que l exploitation des données remise en fichiers Excel au porteur. Une formation pourra être dispensée à la demande Pour les analyses morphologiques détaillées, les images sont remises au porteur qui les traite personnellement Les laboratoires publics et privés ont accès à la plate-forme sur une base de tarification différentielle. Le coût de facturation sera défini pour chaque projet.

22 Merci de votre attention Du gène à l écosystème Du laboratoire vers la société De l ouest à l Europe