SPECTROMETRIE DE MASSE et HORMONOLOGIE : Le futur des immunodosages?

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1 30 e colloque ACORATA 15 mai 2014 SPECTROMETRIE DE MASSE et HORMONOLOGIE : Le futur des immunodosages? Diane Dufour Pr Guilloteau, Dr Collet, Pr Emond Laboratoire Médecine Nucléaire In-Vitro CHRU Tours SFMN, Groupe de Biologie Spécialisée Gr de travail «Dosage des stéroïdes : de la RIA à la SM» SFBC, Groupe Spectrométrie de masse 1

2 Un peu d histoire 1960 : Yalow et Berson dosage de l insuline par radio-immunologie Bond en avant! Développement endocrinologie 1977 : Rosalyn Yalow Prix Nobel, principe des dosages par radio-immunologie 2

3 Un peu d histoire Dosages radio-immunologiques Gain de spécificité Gain de sensibilité Facilité de réalisation 1984 : G. Köhler, C. Milstein et N. Jerne : Prix Nobel production Ac monoclonaux Immunodosages avec monoclonaux Spécificité ++ Alternatives à radioactivité EIA, FIA, LIA. Automatisation Gain de temps Gain de reproductibilité 3

4 Les immunodosages aujourd hui Qualités Gain de temps Gain de reproductibilité (Fidélité intermédiaire) Limites Spécificité : Problèmes avec les stéroïdes de structures proches et différentes formes (sulfatées ) Anticorps pas suffisamment discriminants Sensibilité : Difficulté dans les concentrations faibles (ex: testostérone) 4

5 Les immunodosages aujourd hui Solution aux limites de spécificités Immunodosages après séparation chromatographique (méthode développée à St Louis) Extraction des stéroïdes du sérum solvant Cyclohexane+Acétate d éthyle Séparation sur célite rendement extraction avec stéroïdes tritiés solvant Isooctane+ 0% dichlorométhane Isooctane+ 5% dichlorométhane Isooctane+ 9% dichlorométhane Isooctane+ 30% dichlorométhane Isooctane+ 47% dichlorométhane stéroïdes Δ4-androstènedione Déhydroépiandrostérone (DHA) Testo + 17OH P 17 OH pregnenolone 11 Désoxycortisol Polarité croissante 5

6 Les immunodosages aujourd hui Solution aux limites de spécificités Immunodosages après séparation chromatographique Qualités Gain de spécificité Reproductibilité +/- Limites Nécessité de traceurs tritiés (rendement) (problème de fournisseur) Volume important (> 1 ml de sérum par dosage) 6

7 La spectrométrie de masse, une alternative? Spectromètre triple quadripôle (Waters ) 7

8 La spectrométrie de masse, une alternative? Principe d un spectromètre triple quadripôle en MRM HPLC Séparation chromatographique Sélection Ion parent Fragmentation Sélection Ion fils Quantification 8

9 Application au dosage des stéroïdes Principe d un spectromètre triple quadripôle en mode MRM Adapté à la séparation de petites molécules : Dosage Stéroïdes Difficultés dues aux concentrations faibles dans sérum mais aussi urine, salive Nombreux métabolites et formes liées Interférences médicamenteuses 9

10 Application au dosage des stéroïdes 10

11 Application au dosage des stéroïdes Dosage Stéroïdes, réalisation en routine Dosage simultané d un panel d analytes Ex: 11

12 Application au dosage des stéroïdes Dosage Stéroïdes, réalisation en routine Ajout standards internes deutérés + solution d extraction et précipitation 1- Préparation des échantillons Récupération du surnageant Evaporation Reconstitution Injection 12

13 Application au dosage des stéroïdes Dosage Stéroïdes, réalisation en routine 7 calibrateurs pour établir la gamme 3 contrôles début + fin de série Calcul des concentrations à partir du rapport (aire pic analyte) / (aire pic standard interne) => s affranchir variations d ionisation, de matrices etc. 13

14 Application au dosage des stéroïdes Dosage Stéroïdes, réalisation en routine 2- Séparation chromatographique Colonne C8 phase inverse Variation sur le TR d environ 3% 14

15 Application au dosage des stéroïdes Dosage Stéroïdes, réalisation en routine 3- Spectrométrie de masse en tandem Sélection Fragmentation ionisation Sélection Ion moléculaire M+1 Molécules Fragments 15

16 Application au dosage des stéroïdes Dosage Stéroïdes, réalisation en routine 4- Vérification Analytique Ion quantifiant (97) Analyte Ion qualifiant (109) Standard interne deutéré 16

17 Application au dosage des stéroïdes Dosage Stéroïdes, réalisation en routine 4- Vérification Analytique Analyte ex. Tr (min) Ion moléculaire ion quantifiant ion qualifiant Androstènedione 4, Déoxycortisol 3, Testostérone 4, OHP 5, Cortisol 2, Obtention d un panel d analytes (selon les standards internes/calibrateurs disponibles) Durée totale : 8-10 min / échantillon pour l ensemble du panel 17

18 Application au dosage des stéroïdes Qualités et limites de ces dosages par spectrométrie de masse? Expérience du CHRU de Tours lors de vérification de méthode Spectromètre triple quadripôle (Waters ) Kit Stéroïdes (PerkinElmer ) 18

19 Spectrométrie de masse, qualités Fidélité Intermédiaire (reproductiblité) 11 Désoxycortisol (LC/MS/MS) Moyenne (nmol/l) 0,80 3,98 29,71 Ecart Type 0,07 0,19 0,95 CV% 8,49 4,73 3,20 Valeurs de référence : < 3,9 nmol/l 11 Désoxycortisol RIA (Diasource ) Facteur 3 à 4 Moyenne(nmol/L) 2,56 5,32 23,9 Ecart type 0,28 0,75 3,0 CV% 11,12 14,09 12,5 Valeurs de référence : 1,4 à 5,8 nmol/l 19

20 Spectrométrie de masse, qualités Fidélité Intermédiaire (reproductiblité) Testostérone (LC/MS/MS) Moyenne (nmol/l) 0,44 1,96 14,09 Ecart Type 0,06 0,12 0,65 CV% 13,20 5,89 4,64 Valeurs de référence femme adulte : < 1,9 nmol/l Valeurs de référence homme adulte : 7,2 à 24,2 nmol/l Testostérone (Immulite Siemens ) Facteur 2 à 4 Moyenne (nmol/l) / 1,59 24,47 Ecart Type / 0,34 2,52 CV% / 21,25 10,30 Valeurs de référence femme adulte : 0,8 à 2,9 nmol/l Valeurs de référence homme adulte : 8,7 à 34,7 nmol/l 20

21 Spectrométrie de masse, qualités Fidélité Intermédiaire (reproductiblité) Testostérone (LC/MS/MS) Moyenne (nmol/l) 0,44 1,96 14,09 Ecart Type 0,06 0,12 0,65 CV% 13,20 5,89 4,64 Valeurs de référence femme adulte : < 1,9 nmol/l Valeurs de référence homme adulte : 7,2 à 24,2 nmol/l Castration chimique : pour testostérone < 1,7 nmol/l : CV amélioré Testostérone (Immulite Siemens ) Moyenne (nmol/l) / 1,59 24,47 Ecart Type / 0,34 2,52 CV% / 21,25 10,30 Valeurs de référence femme adulte : 0,8 à 2,9 nmol/l Valeurs de référence homme adulte : 8,7 à 34,7 nmol/l 21

22 Spectrométrie de masse, qualités Limites de linéarité 11 Désoxycortisol (LC/MS/MS) Limite de linéarité Valeurs de référence : < 3,9 nmol/l Seuil inférieur : 0.08 Seuil supérieur : Désoxycortisol RIA (Diasource ) Facteur 3 à 4 Limite de linéarité Seuil inférieur : 0.32 Valeurs de référence : 1,4 à 5,8 nmol/l Seuil supérieur :

23 Spectrométrie de masse, qualités Limites de linéarité Testostérone (LC/MS/MS) Limite de linéarité Seuil inférieur : 0,07 (bémol) Seuil supérieur : 115 Valeurs de référence femme adulte : < 1,9 nmol/l Valeurs de référence homme adulte : 7,2 à 24,2 nmol/l Facteur 10 Testostérone (Immulite Siemens ) Limite de linéarité Seuil inférieur : 0,7 Seuil supérieur : 55 Valeurs de référence femme adulte : 0,8 à 2,9 nmol/l Valeurs de référence homme adulte : 8,7 à 34,7 nmol/l 23

24 Spectrométrie de masse, qualités Qualités de la LC/MSMS HPLC Fidélité Intermédiaire ++ Limite de Détection ++ Spécificité +++ assurée par : MS / MS 24

25 Spectrométrie de masse, qualités Qualités de la LC/MSMS Fidélité Intermédiaire ++ Limite de Détection ++ Spécificité +++ Qualités analytiques 25

26 Spectrométrie de masse, qualités Qualités de la LC/MSMS Fidélité Intermédiaire ++ Limite de Détection ++ Spécificité +++ Qualités analytiques Analyse simultanée de plusieurs analytes Volume d échantillon réduit (100 µl) Analyse sur différentes matrices ex: échantillon salivaire 26

27 Spectrométrie de masse, mais aussi limites Limites de la LC/MSMS Technologie délicate ++ Formation délicate du personnel Investissement matériel ++ Limites de spécificité si : molécules temps de rétention proche (HPLC pas de séparation) isobares (SM pas de séparation) mêmes fragments (SM pas d identification) Ex : Métabolites Série non validée Ex : DOC et 17OHP : mêmes fragments, seul le TR est 27

28 Spectrométrie de masse, mais aussi limites Quelques travaux encore nécessaires Nécessiter de comparer les protocoles (appareils différents, kit ou dosage maison etc.) 28

29 Spectrométrie de masse, mais aussi limites Quelques travaux encore nécessaires Nécessiter d EEQ actuellement absence d EEQ pour 11C 29

30 Spectrométrie de masse, mais aussi limites Quelques travaux encore nécessaires Nécessiter de valeurs de référence adaptées (notamment pédiatriques, tests dynamiques etc.) Classe d âge / sexe Homme 0-6ans 7-9ans 10-11ans 12-13ans 14-15ans 16-17ans 18-52ans Tanner 1 Tanner 2 Tanner 3 Tanner 4-5 Femme 0-6ans 7-9ans 10-11ans 12-13ans 14-15ans 16-17ans 18-51ans Tanner 1 Tanner 2 Tanner 3 Tanner 4-5 Classe d âge / sexe Homme 0-11m 1-6ans 7-12ans Kushnir 06 (API 4000 MDS) % < 0.63 ng/ml (n=126) < 0.70 ng/ml (n=83) <1.05 ng/ml (n=83) <1.52 ng/ml (n=84) <1.93 ng/ml (n=84) ng/ml (n=44) <0.62 ng/ml (n=171) <1.04 ng/ml (n=80) <1.51 ng/ml (n=83) ng/ml (n=122) % < 0.71 ng/ml (n=126) < 0.89 ng/ml (n=83) <1.65 ng/ml (n=83) ng/ml (n=83) <1.79 ng/ml (n=83) ng/ml (n=56) <0.74 ng/ml (n=181) <1.64 ng/ml (n=76) ng/ml (n=98) ng/ml (n=104) Classe d âge / sexe Homme 0-6 mois 6m-18ans Femme 0-6 mois 6m-6ans 6-10ans 10-18ans Rauh 06 (API4000 MDS) Classe d âge / sexe median, range nmol/l Homme >18 ans Soldin 09 (API 5000 Shimadzu) % ng/ml (n=119) ng/ml (n=153) % ng/ml (n=119) ng/ml (n=132) ng/ml (n=182) ng/ml (n=144) Fanelli 11 (API QTrap) % ng/ml (n=217) Classe d âge / sexe Homme <1 sem 2 sem-2m 3-11m 1-6ans 7-12ans 13-15ans >16ans Femme <1 sem 2 sem-2m 3-11m 1-6ans 7-12ans 13-15ans >16ans Kulle 13 (Waters Quattro XE) % ng/ml (n=14) ng/ml (n=27) ng/ml (n=31) ng/ml (n=51) ng/ml (n=101) ng/ml (n=60) ng/ml (n=66) % ng/ml (n=9) ng/ml (n=25) ng/ml (n=20)) ng/ml (n=99) ng/ml (n=222) ng/ml (n=95) ng/ml (n=86) Classe d âge / sexe Kyriakopoulou 13 (API QTrap) 1 ng/ml = nmol/l Homme % nmol/l n= Synthèse bibliographique? 30

31 Spectrométrie de masse, mais aussi limites Quelques travaux encore nécessaires Nécessiter d adapter les protocoles pour les différents milieux (sérum, urine, salive, buvard etc.) 31

32 La spectrométrie de masse, une alternative? Immunodosages LC/MS/MS Spécificité Sensibilité Reproductibilité rapidité de réalisation Coût + ++ Investissements

33 La spectrométrie de masse, une alternative? Complémentarité LC/MSMS et Immunodosages Immunodosages Estradiol Progestérone Cortisol sanguin grandes séries, spécificités et sensibilités suffisantes, rendu quotidien indispensable LC/MSMS Testostérone 17OH-P 11-C 4 Androstènedione besoin grandes spécificités et sensibilités Protéines/Peptides challenges et développements en cours 33

34 La spectrométrie de masse, une alternative? Applications pour la fertilité? Pubertés anormales Dosages sensibles de testostérone => seuil de détection distinct du seuil de normalité (<0.7 nmol/l en Tanner 1 H/F) Dosages spécifiques d un panel d hormones stéroïdiennes => dosages simultanés possibles 17OHP, 11C, androstènedione 34

35 La spectrométrie de masse, une alternative? Applications pour la fertilité? Insuffisances gonadotropes Dosages sensibles de testostérone Dosages sensibles d estradiol (bémol car difficultés analytiques, intérêt?) Hyperandrogénies Dosages spécifiques d un panel d hormones stéroïdiennes => dosages simultanés possibles 17OHP, 11C, androstènedione Domaine de mesure étendu (excellente linéarité), dilution : délai de rendu des résultats Développement en cours ou en perspectives selon les questions cliniques! 35

36 La spectrométrie de masse, une alternative? SPECTROMETRIE DE MASSE et HORMONOLOGIE : Le futur des immunodosages? Avenir : Immunodosages + LC/MSMS Je vous remercie de votre attention Toute utilisation des éléments présentés doit être soumise à l autorisation de l organisation 36