Des OGM et d André Yves Bertheau INRA Versailles

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1 Des OGM et d André 1999 Yves Bertheau INRA Versailles

2 Les OGM en Europe Refus de nombreux consommateurs Étiquetage et coexistence pour assurer le libre choix des consommateurs et producteurs L utilisation préférentielle d une technique: la QRT-PCR, également très utilisée dans d autres domaines comme la détection des pathogènes ou l expression de gènes Une quantification relative

3 Quelques difficultés de compréhension initiales

4 Mais une volonté et une capacité de traduction importantes

5 La QRT-PCR Denaturating Hybridization Polymerization R = Rapporter Q = Quencher forward primer R Q INRA PMDV / MDO

6 La QRT-PCR

7 Etapes et problèmes Boites noires: acquisition d images, «mastermixes» de QRT-PCR Extraction d ADN: inhibiteur? Optimisation des PCR quantitatives puis restreintes aux PCR qualitatives Détection des OGM non autorisés: Inconnus empilés

8 Contrôle qualité: quantification par attributs et inhibiteurs Une possibilité de déterminer la quantité d OGM versus un seuil

9 Calibrations en utilisant des dilutions de l échantillon et du matériel de référence

10 Déterminer l intervalle de confiance de Fieller avec des dilutions

11 Répétabilité des extractions d ADN

12 Autres travaux Rédaction et participation à de nombreux «livrables» des programmes européens : QPCRGMOfood, GMOchips, SIGMEA & Co-Extra Correction de normes CEN / ISO Contrôles des animaux nourris ou non avec des OGM Difficilement exploitable sous forme d articles mathématiques mais fondamentaux pour une équipe de biologie moléculaire Avec des formations du réseau français de détection des OGM

13 Optimisation de PCR PCR quantitatives puis utilisation des «mastermixes» PCR qualitatives de plus en plus utilisées (multiplex pour faire face au nombre croissant d OGM commercialisés, approche matricielle pour la détection d OGM non autorisés) A côté de considérations moléculaires, un cauchemar de facteurs en interaction : quantité et proportion d amorces, Mg en sus des inhibiteurs potentiels inconnus

14 Optimisation de PCR multiplex Forward Primer Reverse Primer MAIZE GMO insert GMOs specific PCR products Bt11 T25 ADH Bt176 Mon bp 171 bp 151 bp 134 bp 90 bp

15 Optimisation de PCR multiplex Bt11 Adh Bt176 T25 Mon810 Bt 176 Adh Bt 176 Adh T25 Mon 810 Simplex PCRs with specific primers Multiplex before optimisation (2,000 and 200 copies each GMO) Multiplex after optimisation (2,000 and 200 copies each GMO) «Randomisation» : avec un «détrompeur»

16 La détection d OGM inconnus par PCR quantitative différentielle dq-pcr Quantification d une séquence, commune à un groupe d OGM Amorces spécifiques à un élément commun (e.g. P35S ) Quantification de tous les OGM autorisés présentant cet élément consensus Amorces spécifiques de chacun de ces OGM (e.g. fragments de bordure) Inserts of GMOs Thèse V. Ancel

17 Détection d OGM inconnus par dq-pcr Séquences communes : P35S OGM autorisés contenant P35S: Mon 810, T25, Bt176 + OGM inconnus = quant P35S -(quant Mon810 + quantt25 + quant Bt176 ) Test =0 Applicable aux autres séquences de criblage Tnos, Pnos, T35S, CryIA(b), EPSPS, etc. avec les contrôles (CaMV, Agrobacterium, etc.) Première technique applicable directement dans les laboratoires Au moindre coût

18 Article en cours de finalisation : validation inter-laboratoires de la dq-pcr Première validation d une méthode de détection d OGM inconnus

19 Les empilages de gènes (thèse V. Ancel) Mon810 T25 Bt11 Bt11 Mon810 Bt11 T25 Mon810 T25 Mon810 T25 Mon810 T25 Mon810 Bt11 Comment différencier les OGM de ces Échantillons dont certaisn peuvent être non Autorisés Japon : analyse graine à graine

20 Les empilages de gènes PCR qualitatives: avec S. Huet et H. Monod PCR quantitatives: plus d information, modélisation Similarités, par exemple avec la recherche de pathogènes multi-résistants à des biocides

21 PCR qualitatives Un besoin croissant d optimisation des PCR simplex et multiplex, ex: puces à ADN, pour réduire les coûts, rendre les PCR robustes, faire face au nombre croissant d OGM dont ceux non autorisés, avec une analyse des résultats (ex : DSS)

22 Merci André pour ta rigueur, ton expérience, tes idées, ton calme et ta réactivité Le MDOteam

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