Laboratoire National de Référence de la Fièvre de la Vallée du Rift - diagnostic sérologique Rapport d activité, année 2011
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- Gaston Généreux
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1 Laboratoire National de Référence de la Fièvre de la Vallée du Rift - diagnostic sérologique Rapport d activité, année 2011 Introduction Les maladies virales transmises par les arthropodes hématophages (arboviroses) rassemblent un grand nombre de pathologies affectant différentes espèces animales et/ou l homme. Pour certaines de ces pathologies, l impact en santé publique et les répercussions économiques peuvent être lourdes tant du point de vue humain qu animal. Elles présentent un potentiel avéré d émergence et/ou d extension { de nouveaux territoires, y compris en zone tempérée, du fait de la présence de vecteurs. L extension des aires de répartition des arthropodes vecteurs et la colonisation de nouvelles zones géographiques soulèvent ainsi de nouvelles questions en terme d évaluation de risque sanitaire. C est notamment le cas de la Fièvre de la Vallée du Rift (FVR) qui a connu au cours de ces dernières années une progression lente mais continue de son aire de distribution. L unité virologie du laboratoire de Lyon, a été créée en janvier 2011 et héberge le Laboratoire National de Référence pour la Fièvre de la Vallée du Rift - Diagnostic sérologique (Arrêté du 19 octobre 2011 modifiant l arrêté du 29 décembre 2009 désignant les laboratoires nationaux de référence dans le domaine de la santé publique vétérinaire et phytosanitaire, JO du 28 octobre 2011). Elle participe également au Laboratoire de Référence OIE pour la Fièvre de la Vallée du Rift et la Fièvre Hémorragique de Crimée-Congo, dirigé par Michèle Bouloy (Partenariat avec l Unité de Génétique Moléculaire des Bunyaviridae, M. Bouloy, le CNR des Arbovirus P. Desprès et le CNR des Fièvres Hémorragiques Virales, N. Tordo, trois équipes de l Institut Pasteur). Les missions de cette unité sont : (i) mettre en place et améliorer le diagnostic de la FVR (sérologie : ELISA et séroneutralisation ; RT-PCR classique et en temps réel ; isolement viral), (ii) développer les techniques d étude des vaccins disponibles et des candidats vaccins destinés à protéger les animaux sensibles (les ruminants essentiellement) et (iii) proposer un plan de surveillance de la FVR pour mieux se préparer à une possible émergence de ce virus en France et en Europe. Le virus de la Fièvre de la Vallée du Rift est un virus de classe 3 qui est soumis à déclaration { l Afssaps (autorisation d acquisition, détention, mise en œuvre ; cession ; importation) en tant que Micro-Organisme pathogène et Toxine (MOT) listé dans l arrêté du 30 juillet Organigramme du LNR Noms Fonction ETP Ph. Marianneau Chef d unité 0,5 S. Lacôte Ingénieur d étude 0,5 Présentation des locaux et des équipements L unité virologie dispose d un laboratoire P3 d environ 65 m 2 dédié uniquement à l activité FVR et autres Bunyaviridae. Ce laboratoire P3 est divisé en 3 laboratoires indépendants dans lesquels plusieurs pathogènes peuvent être manipulés en toute Page 1
2 sécurité. La mise en service du laboratoire s est réalisée progressivement après remise à niveau et vérification de la structure, équipement matériel, rédaction des procédures générales et spécifiques d utilisation et validation de ces procédures. Ce laboratoire P3 répond désormais à toutes les exigences préconisées pour les laboratoires de recherche travaillant sur des agents pathogènes classés dans le groupe 3 selon l arrêté du 16 juillet L unité virologie dispose également pour son usage exclusif d un ensemble de 4 laboratoires d une surface totale d environ 80 m 2 installés dans un module extérieur indépendant des autres laboratoires du site. Ces 4 laboratoires (culture cellulaire, laboratoire P2, laboratoire de biologie moléculaire et laboratoire de préparation) permettent de réaliser toutes les manipulations hors agent infectieux. L unité virologie dispose d un équipement complet avec une plateforme de sérologie (PSM type II, laveur et lecteur de plaques, centrifugeuses), une plateforme de biologie moléculaire thermocycleurs, machine pour PCR en temps réel Light-Cycler 480 (Roche), une plateforme culture cellulaire (PSMs et incubateurs dédiés aux lignées saines et aux cultures virales). Du matériel pour le broyage d organe (Tissue Lyzer), l expression de protéines recombinantes (bactériologie) et une ultracentrifugeuse pour la purification des virus viennent compléter l équipement. Au sein du laboratoire de Lyon, l unité virologie a accès à la plateforme d expérimentation animale qui a récemment équipé une de ses salles d hébergement avec un portoir de 30 isocages et un PSM de type II adaptée à la manipulation des isocages, afin de pouvoir mener des expérimentations sur les rongeurs en condition A3. Enfin, l unité virologie a la possibilité de réaliser des expériences chez l animal-cible, le mouton, dans la structure INPREST de la plate-forme d Infectiologie Expérimentale (PFIE) de l INRA-Nouzilly (près de Tours) (correspondants : Drs B. Schwartz & P. Sarradin) Faits marquants de l année Au plan international, l année 2011 a été particulièrement calme en épisodes d infection par le virus de la Fièvre de la Vallée du Rift répertoriés. Pour la quatrième année consécutive des foyers d infections ont été détectés en Afrique du Sud dès le mois de janvier. Pour la première fois une épidémie a été détectée dans un élevage d Alpagas entraînant la mort de plusieurs animaux. Les mois suivants ont cependant été beaucoup plus calmes en Afrique du Sud et aucun autre cas n a été rapporté. En France, un diagnostic positif (ELISA IgM) pour la FVR réalisé à l hôpital de Bordeaux sur un patient qui revenait du Zimbabwe a été rapporté avant d être infirmé par des analyses complémentaires réalisées au CNR des arbovirus. Cet épisode illustre bien la complexité de poser un diagnostic mais surtout la nécessité d utiliser des techniques complémentaires pour pouvoir disposer de résultats cohérents et fiables. Activités d analyses, activités de laboratoire expert, activités d EST 1 Méthodes disponibles au LNR Il n existe pas de méthodes normalisées (ISO, CEN, NF) pour la FVR. Les méthodes recommandées par l OIE pour la sérologie RVF (manuel OIE 2004 chapitre p185) sont la séroneutralisation, l ELISA avec protéine G couplée { la peroxydase et l inhibition d hémagglutination. L unité virologie, depuis sa mise en place, a acquis et maîtrise désormais toutes les techniques usuelles pour le diagnostic du virus de la FVR. Page 2
3 Bien que LNR-diagnostic sérologique, l unité virologie s est attachée à développer aussi bien le diagnostic sérologique que le diagnostic moléculaire/virologique. Diagnostic sérologique (diagnostic indirect): o Technique Elisa : Elisa sandwich pour le dosage des anticorps d isotype IgM (bovins, ovins & caprins) Elisa indirect pour le dosage des anticorps d isotype IgG (bovins, ovins & caprins) Elisa compétition pour le dosage des Ig anti-fvr chez toute espèce animale susceptible d être infectée par le virus de la FVR (évite l utilisation d un anticorps secondaire spécifique d espèce) Elisa indirect { base d antigène N recombinant o Séroneutralisation (test de neutralisation par réduction de plages) Des kits commerciaux pour la sérologie (Elisa IgG et IgM) sont disponibles chez 2 fournisseurs principaux : BDSL et IdVet. Le LNR a participé aux validations finales du kit Elisa IgM de la société IdVet. A coté de l utilisation de ces kits commerciaux qui peuvent certaines fois être difficiles à obtenir (notamment le cas chez BDSL), le LNR développe ses propres outils de détection qui sont ensuite validés par rapport aux kits commerciaux. Origine Technique Remarque BDSL Elisa IgM (bovin, caprin, ovin) disponible au LNR Elisa IgG (bovin, caprin, ovin) disponible au LNR Elisa compétition (toute espèce) disponible au LNR IdVet Elisa IgM (ruminant, caprin, ovin) disponible au LNR Elisa compétition (toute espèce) disponible au LNR LNR Elisa indirect IgG Validé sur bovin et ovin Antigène utilisé : Lysat de cellules infectées Elisa indirect IgG Antigène utilisé : Protéine recombinante N RVF purifiée Validé techniquement sur bovin et ovin Mac Elisa IgM En cours de validation Antigène utilisé : Slurry de cellules infectées technique sur ovin et bovin LNR Séroneutralisation par réduction de plage Validée Diagnostic moléculaire/virologique (diagnostic direct) : o Isolement viral { partir du sang total, du sérum ou d organes infectés sur cellules Vero o Diagnostic moléculaire par : RT-PCR classique RT-PCR en temps réel (sur appareil Roche LC 480) Lamp PCR (réaction isothermique à 60 C) Technique Référence Cible Remarque Isolement sur culture cellulaire Procédure LNR Virus Validée infectieux Isolement sur cerveaux de Procédure LNR Virus souriceaux infectieux RT-PCR et Nested PCR Sall et al. (2001) Segment S Validée qrt-pcr Sybr green Näslund et al. (2008) Segment S Validée qrt-pcr sonde taqman Drosten et al. (2002) Segment M Validée qrt-pcr sonde taqman Bird et al. (2007) Segment L Validée Lamp PCR Peyrefitte et al. (2008) Segment L Non validée En cours de validation Page 3
4 La technique de Lamp PCR présente l avantage d être isothermique (toute la réaction s effectue { 60 C) et le produit final est détectable par simple néphélométrie ou même { l œil nu. Elle permet d envisager la mise au point d appareils très simples, restant utilisables et performants dans des conditions de terrain. Certaines de ces méthodes de diagnostic sont parfaitement transférables vers des laboratoires de diagnostic vétérinaire agréés (ELISA, RT-PCR, ) sous réserve d une formation et d un suivi de ces laboratoires. A terme ce transfert pourrait être envisagé après validation par les autorités sanitaires. Validation des méthodes d analyse : Une étude réalisée en 2009 sur plus de 2500 sérums ovins, bovins et caprins d origine française a permis de préciser l excellente spécificité des tests ELISA disponibles sur le marché pour la sérologie de la FVR (kits IgM et IgG BDSL). L ensemble de ces résultats a été rassemblé dans une publication parue dans la Revue de Médecine Vétérinaire Les antigènes produits par le LNR (cellules infectées ou protéine recombinante) sont validés systématiquement par comparaison avec les kits commerciaux (BDSL et IdVet) avec les prélèvements d animaux infectés naturellement ou expérimentalement disponibles dans la sérothèque du LNR. Les objectifs futurs sont donc de terminer la validation des techniques Elisa IgG et IgM avec les réactifs produits au LNR mais également de commencer la validation des techniques d isolement viral sur cerveaux de souriceaux et de Lamp-PCR. Souches virales détenues par le LNR : Compte tenu du classement du vfvr parmi les agents de la liste des MOT (Arrêté du 30 juillet 2004), l unité et son responsable scientifique, P. Marianneau dispose d une autorisation AFSSAPS pour l acquisition, la détention et la mise en œuvre des souches du vfvr Les souches sont conservées dans un congélateur -80 C situé dans le P3. La traçabilité des souches (et leurs produits dérivés (ARN, antigènes)) et des sérums animaux est assurée grâce à un enregistrement informatique. Le LNR possède 2 souches atténuées : - Souche Smithburn - Souche Clone13 et 5 souches virulentes - Souche Kenya 97 - Souche MP12 - Souche ZH Souche ZH548 - Souche Mayotte 08 2 Activités d analyses et d expertises Il n y a pas eu d analyse demandée au LNR pour une suspicion d infection sur le territoire national. Au cours de l année 2011 le LNR a été sollicité pour effectuer des analyses sur des animaux d un cirque parti en tournée en Afrique et qui souhaitait obtenir un statut sanitaire des animaux avant leur retour en France. Les autres analyses du LNR ont été réalisées, comme en 2010, à travers des collaborations avec le CIRAD sur des sérums d animaux en provenance de Madagascar et du Zimbabwe sérums de bovins en provenance de Madagascar dans le cadre d une étude de suivi de la séroprévalence dans plusieurs villages malgaches. Page 4
5 - 49 sérums d animaux (vaches, chèvres, moutons, buffles, impalas et zèbres) en provenance du Zimbabwe. Ces différentes études (plus les animaux immunisés/infectés expérimentalement) permettent au LNR de disposer d une sérothèque importante, utile pour la validation de nouvelles techniques ou pour avoir des témoins positifs des techniques couramment utilisées. Analyse de l évolution des tendances en termes d activité La Fièvre de la Vallée du Rift (FVR) a connu au cours de ces dernières années une progression lente mais continue de son aire de distribution. L agent étiologique de la FVR est un virus qui appartient au genre phlébovirus dans la famille des Bunyaviridae : le virus de la Fièvre de la Vallée du Rift (vfvr). Ce virus, qui a provoqué des épizooties et épidémies majeures incluant de nombreux cas de fièvres hémorragiques en Afrique de l Est (Kenya, Tanzanie, Somalie, Soudan), n avait jusqu en 2007 jamais été identifié dans un territoire français. En 2007, un premier cas importé en provenance de la Grande Comores avait été confirmé à Mayotte. En 2008, 9 cas humains autochtones de FVR ont été confirmés par le CNR des Arbovirus (Institut Pasteur) à Mayotte. Aucun cas autochtone de RVF n a été identifié jusqu alors en France métropolitaine. Participation aux activités de surveillance Contribution à la surveillance nationale Un plan de surveillance et d urgence FVR pour la France métropolitaine a été élaboré en 2009 par Maëlle Dampfhoffer, stagiaire de l'ehesp de Rennes. Ce plan a pour objectifs de permettre la détection précoce de la circulation du vfvr en France métropolitaine et de proposer des mesures de contrôle et d élimination du virus visant { la prévention et { la protection de la santé publique. Ce travail a été communiqué à la DGAL mais aucune suite n y a apparemment été apportée. Hormis la notification obligatoire, la surveillance du vfvr ne fait pas l objet d une surveillance formalisée sur le territoire national. Activités d animation de réseau de laboratoires, d information, de formation et de conseil Organisation d EILA Aucune campagne d EILA n a été organisée ou planifiée jusqu'à présent. Activités de recherche en lien avec l activité de référence Développement et amélioration des tests sérologiques Le LNR FVR participe à un programme transversal de recherche Institut pasteur/anses, dont les objectifs principaux sont de standardiser les protocoles de diagnostic viral entre les CNR { l Institut Pasteur et les LNR de l Anses, et de développer puis de valider de nouveaux outils moléculaires plus sensibles et spécifiques pour le diagnostic sérologique en utilisant des antigènes viraux recombinants. Le système d expression en cellules de Drosophile S2 (DES, Invitrogen) est particulièrement bien adapté pour la production en grande quantité de protéines arbovirales dont l antigénicité s est avérée comparable { celle de la molécule virale native. Cette méthode a été mise en place au CNR arbovirus (Institut Pasteur). Les séquences codant les protéines virales d intérêt sont soit des ADNc obtenus { partir des génomes viraux, soit des gènes synthétiques dont les codons sont optimisés. Nous avons ainsi obtenu dans ce système la protéine N du vfvr qui a été produite en grande quantité, purifiée puis testée en sérologie en comparaison des protéines virales Page 5
6 natives. Les résultats obtenus montrent que les ELISA indirects développés présentent une spécificité et une sensibilité quasiment similaires à ceux développés avec les protéines virales natives. Etude de l innocuité et de l efficacité des vaccins vétérinaires contre la FVR Une première expérience de vaccination de moutons avait été réalisée { l INPREST de l INRA Nouzilly. Cette expérience avait permis de : - Valider les conditions de biosécurité de l expérimentation en milieu confiné A3 - Tester l activité de trois vaccins commerciaux d origine sud-africaine, un vaccin à virus inactivé et deux vaccins à virus atténué (souche Smithburn et clone 13) L expérimentation s est déroulée sur douze semaines avec 24 moutons (8 animaux / lot) qui ont été régulièrement prélevés. L ensemble des résultats obtenus fait l objet d une publication en cours d écriture. En 2011, nous avons poursuivi cette première expérimentation par la mise au point d un modèle d infection expérimentale du mouton par une souche virulente. Pour cela nous avons testé 2 souches virulentes avec deux doses virales différentes sur des groupes de 5 moutons de 4 mois environ. Des prélèvements séquentiels ont été réalisés sur chacun des animaux de chaque groupe et les analyses sont actuellement en cours de réalisation. Les résultats obtenus devraient nous permettre de mieux comprendre les interactions virus-mouton mais également de disposer d un test d épreuve pour évaluer le pouvoir protecteur des vaccins. Liste des publications et communications Fernandez JC, Billecocq A, Durand JP, Cêtre-Sossah C, Cardinale E, Marianneau P, Pépin M, Tordo N, Bouloy M. The non-structural protein NSs induces a variable antibody response in domestic ruminants naturally infected with Rift Valley fever virus. Clin. Vaccine Immunol Nov 9. [Epub ahead of print] Orientations futures Le LNR s oriente vers une démarche de certification d une méthode de sérologie de référence pour le diagnostic FVR. Page 6
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