Stress oxydatif et réponse antioxydante

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1 Université Paris Saclay, Master 1 Biologie santé, Parie Biologie cellulaire Partie II : Stress et réponses cellulaires Stress oxydatif et réponse antioxydante Hind Guenou hind.guenou@inserm.fr Vivre avec l'oxygène et la chimie redox Les sources du stress oxydant Les réponses aux stress oxydant

2 Vivre avec l'oxygène et la chimie redox Le paradoxe de l oxygène étant que c est un poison auquel la vie s est adaptée.

3 Les sources du stress oxydant Définition : Toutes les cellules aérobies produisent en permanence des espèces réactives de l oxygène qui sont neutralisées immédiatement par les antioxydants Un radical ou radical libre désigne un atome ou une molécule qui possède un électron non apparié. Quelle sont ces espèces réactives? Formes réactives d oxygen (FRO) ou Reactive Oxygen Species (ROS) Certains ROS, pas toutes, sont des radicaux libres 3

4 Les sources du stress oxydant Les responsables du stress oxydant (espèce réactives de l oxygène et de l azote) ROS-dérivés d oxygène RNS-dérivés d azote dioxygène : O 2 superoxyde : 2O 2 - Radical hydroxyle : OH O 2 peroxynitrite : ONOO - Monoxyde d azote: NO Peroxyde d hydrogène : H 2 O 2 Acide hypochloreux : HOCl 4

5 2-1 Les principaux oxydants Réactions de transformation Réduction d O 2 à H 2 O liée au métabolisme cellulaire Fuite d e produisant superoxyde par enzyme oxydase Production de peroxyde d hydrogene par SOD Réaction de Fenton pour production du radical hydroxyle Dismutation par Catalase avec 2 molécules de H2O2 Ou reduction par gluthation avec 1 molécule de H2O2 Les membranes cellulaires sont perméables au H 2 O, à l aide d aquaporines 5

6 2-2 Les principaux sources de stress oxydant et leur activation Produits secondaires du métabolisme cellulaire Chaîne respiratoire : Fuite d e produisant superoxyde par enzyme oxydase Mitochondrie (respiration cellulaire) O 2 -

7 2-2 Les principaux sources de stress oxydant et leur activation Produits secondaires du métabolisme cellulaire Métabolisme de l'acide urique

8 2-2 Les principaux sources de stress oxydant et leur activation Produits secondaires du métabolisme cellulaire Synthèse des prostaglandines et des leukotriènes Cycloxygenase 8

9 2-2 Les principaux sources de stress oxydant et leur activation Produits secondaires du métabolisme cellulaire Métabolisme des xénobiotiques 9

10 2-2 Les principaux sources de stress oxydant et leur activation Produits (EROS, ENOS) par des enzymes Spécifiques d un type cellulaire. Nitric oxide synthase - NOS NO synthase endotheliale enos (NOS3) NO synthase neuronale nnos (NOS1) nombreux tissues activité régulée Calcium/calmodulin dépendante NO synthase inductible inos (NOS2) système immunitaire Constitutivement active, régulation transcriptionnelle Cytosolique ou attaché aux membranes 10

11 2-2 Les principaux sources de stress oxydant et leur activation Produits (EROS, ENOS) par des enzymes Spécifiques des types cell. Nitric oxide synthase - NOS NOS composition, régulation, fonction NH 2 Oxygenase domain Reductase domain BH 4 Fe Kalyanaraman Redox Biology 2013 CAM C-SH HS-C Zn C-SH HS-C CAM FMN e - e - Fe BH 4 NADP + FAD e - O 2 NADPH COOH Yves Gorin, 11 Texas

12 2-2 Les principaux sources de stress oxydant et leur activation Produits (EROS, ENOS) par des enzymes Spécifiques des types cell. NADPH oxydases (NOX) p22 phox gp91phox p22 phox gp91 phox La NADPH oxydase des phagocytes : assemblage des sous-unités, activation, production de ROS pour détruire des pathogènes 12

13 2-2 Les principaux sources de stress oxydant et leur activation Produits (EROS, ENOS) par des enzymes Spécifiques des types cell. Les NADPH oxydases des mammifères NOX1-5 et DUOX1/2 O O 2 O 2 - O 2 O - 2 O 2 - H 2 O 2 NOX1/3 p22 NOX2 p22 NOX4 p22 NOXO1 NOXA1 rac O 2 O 2 - NOX5 EF p67 rac p47 p40 Constitutive? O 2 H 2 O 2 Perox DUOX A1/A2 DUOX1/2 EF Ca 2+ NOX dans les plantes : RBOH A-F (respiratory burst oxydase homologues) NOX dans les champignons : NOX1-3 et NOX A,B,RAdapté de Lambeth AnnRevPathMechDis2014 NOX dans les procaryotes : peut-être Ca 2+ 13

14 2-2 Les principaux sources de stress oxydant et leur activation Fonctions des NADPH oxydases Destruction de pathogènes par les phagocytes, en cas de déficiences => Granulomatose Septique Chronique (CGD), caractérisé par infections sévères et récurrentes Stasia SeminImmunopath O Neill Redox Biol 2015

15 2-2 Les principaux sources de stress oxydant et leur activation Les mutations de NOX2 identifiés dans les patients de CGD Stasia Seminimmunopath 2008 L analyse des mutants de chaque patient est une source d information sur la relation structure fonction de NOX2 15

16 2-2 Les principaux sources de stress oxydant et leur activation Exemple des fonctions des NADPH oxydases Cas de DUOX et la synthèse des hormones thyroïdiens Iodure +thyroglobuline (TG), sous l influence de la TPO (thyroperoxydase), en présence de H2O2 synthétisé par le système NADPH-oxydase ou Duox-2. Grüters, A. & Krude, H. (2011) Nat. Rev. Endocrinol. 16

17 2-2 Les principaux sources de stress oxydant et leur activation Produits (EROS, ENOS) par energie exogene Scission homolytique des liaisons covalentes A _ B A + B (Nécéssite de l énergie).

18 2-3 Les conséquences d'un stress oxydant Oxydations de biomolécules Sucres, lipides, protéines, et acides nucléiques peuvent être oxydés. Changement de structure et fonction Peroxydation des lipides 18

19 2-3 Les conséquences d'un stress oxydant Oxydations de biomolécules Sucres, lipides, protéines, et acides nucléiques peuvent être oxydés. Changement de structure et fonction Peroxydation des lipides 19

20 2-3 Les conséquences d'un stress oxydant Oxydations de biomolécules Oxydation de cystéine, une conséquence majeure du stress oxydant Produits d oxydation: Sulfenic (Cys-SOH), sulfinic (Cys-SO 2 H), sulfonic acids (Cys-SO 3 H), and disulfide bond (Cys-SS-Cys)

21 2-3 Les conséquences d'un stress oxydant Oxydations de biomolécules Modifications oxydatives des protéines Hamanaka Trends Biochem Sci

22 2-3 Les conséquences d'un stress oxydant Oxydations de biomolécules Modification réversible des groupements thiols des cystéines des protéines Rôle de messagers secondaires H 2 O 2 NO Phosphatases : Inactivées Kinases : activées ou inactivées Ex:Caspases (Inhibition par H 2 O 2 et NO) Ex: Métalloprotéinases (activées par H 2 O 2 et NO) Protéases : activées ou inactivées Régulation des facteurs de Transcription NK B activé par H2O2, inactivé par NO 22

23 2-3 Les conséquences d'un stress oxydant Effets biologiques - Très variées entre cellules et tissus, forte variation en fonction de la dose Hamanaka Trends Biochem Sci

24 2-3 Les conséquences d'un stress oxydant Effets biologiques Les effets cellulaires des ERO et ERN dépendent de leur concentration dans les cellules 24

25 2-3 Les conséquences d'un stress oxydant l'état redox des compartiments cellulaires Le RE est oxydant afin de permettre la formation de ponts disulfures 25 Kojer K BBA 2014

26 2-4 le méthodes de détection du stress oxydant Par définition, les ROS sont réactives donc peu stable, pour les détecter il faut une mesure instantanée ou transformer les ROS en molécules plus stables Les enjeux de la techniques : sensibilité, spécificité, localisation, échelle de temps, détecteur de ROS ou d'état redox 26

27 2-4 Méthodes de détection du stress oxydant RPE - résonance paramagnétique électronique electron spin resonance (ESR) Détection de radicaux (électrons non appariés) Le radical dans l échantillon est piégé (spin trap) par un molécule spécifique qui forme un complexe «adduct» avec le radical L échantillon est placé dans un fort champ magnétique dont on varie la force et exposé à une onde électromagnétique de très haute fréquence L appareil mesure l absorption de cette onde par l échantillon DEPMPO Spectre RPE de DEPMPO-O 2 - Dérivé de l absorption en fonction de la force du champ Site Enzo 27

28 2-4 le méthodes de détection du stress oxydant Chemiluminescence Oxidation de luminol et émission de lumière ROS N 2 + lumière (λ max 460 nm) Mesure des ROS présent à l instant Chémiluminescence (ua) 100 [Ca 2+ ] o = 1 mm [Ca 2+ ] o = temps (min) Phagocytes (HL60) stimulation avec peptide microbien 28

29 2-4 le méthodes de détection du stress oxydant Fluorescence, exemple DCFH 2 oxydation 2- hydrolyse ester Couplage covalent DCFH2- ROS levure protéine 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, succinimidyl ester (OxyBURST Green H2DCFDA, SE) 1- couplage aux amines Fluorescence 29

30 2-4 le méthodes de détection du stress oxydant La GFP comme détecteur d HOCl Neutrophil Bleaching of GFP-Expressing Staphylococci: Probing the Intraphagosomal Fate of Individual Bacteria Schwartz J J Immunol 2009 GFP GFP 30

31 2-4 le méthodes de détection du stress oxydant Le blanchiment de la GFP bleaching est corrélée à la mort des bactéries Schwartz J J Immunol

32 2-4 le méthodes de détection du stress oxydant Nature Methods 2008 Human glutharedoxin1 (GRX1) Redox sensitive GFP (rogfp2) fluorescence GRX1-roGFP2 ER/cytosol ER + DTT cytosol ER HEK293 cells expressing GRX1-roGFP2 ER or GRX1-roGFP2 cytosol Agnes Delaunay, CEA, Saclay excitation (nm) Ratio F405/F480 oxydation 32

33 2-4 le méthodes de détection du stress oxydant Le biosenseur peut être dirigé spécifiquement dans un compartiment cellulaire Exemple GRX1-roGFP2 dans cytosol ou RE Cellules HEK293T cytosol ER 33

34 3 Les réponses aux stress oxydant 3-1 les antioxydants Des molécules antioxydant se trouvent dans de nombreux aliments Des compléments alimentaires sont proposés Vitamine C 34

35 3-1 les antioxydants les système glutathion (GSH) et son recyclage Le tripeptide GSH Oxydation et réduction de GSH ox 2 GSH GSSG red Le recyclage enzymatique du GSH : 35 Kalyanaraman Redox Biology 2013

36 3-1 les antioxydants les enzymes détoxifiants Superoxyde Dismutase (SOD) 2O H + --> H 2 O 2 + O 2 Chez l homme SOD 1,2,3 CuZn-SOD cytosolique, SOD1 Mn-SOD mitochondriale, SOD2 CuZn-SOD extracellulaire, SOD3 Catalase 2 H 2 O 2 --> 2 H 2 O + O 2 Homotetramère, 4 x 500 acides aminées V max = /s Chez les eucaryotes, Catalase A dans peroxysomes Catalase T dans cytosol Peroxidase RH 2 + H 2 O 2 --> R + 2 H 2 O Divers enzymes dans procaryotes et eucaryotes 36

37 3-1 les antioxydants les anti-oxydants alimentaires (vitamines, carotènes, phénols ) Kalyanaraman Redox Biology

38 3-2 l'adaptation de la cellule aux stress oxydant (exemples) le système Nrf2 Kalyanaraman Redox Biology 2013 activation de Nrf2 par un stress oxydant conduit à l expression de multiples gènes de la réponse antioxydante 38

39 3-2 l'adaptation de la cellule aux stress oxydant (exemples) le système HIFa (hypoxia induced factor) L hypoxie augmente la production de ROS par les mitochondries Les ROS bloquent l hydroxylation de HIF1α et la stabilisent HIF1α entre dans le noyau est active la transcription de gènes d adaptation à l hypoxie Hamanaka Trends Biochem Sci

40 3-2 l'adaptation de la cellule aux stress oxydant (exemples) la réponse d'un microorganisme aux stress oxydant induit par le système immunitaire Source ROS endogènes et exogènes Imlay AnnRev Bioch

41 3-2 l'adaptation de la cellule aux stress oxydant (exemples) Les cibles des ROS dans E. coli Imlay CurrOpinMicrob

42 3-2 l'adaptation de la cellule aux stress oxydant (exemples) Signalisation redox dans les plantes => La signalisation redox est très localisée pour certains ROS PitzschkeAntioxRedSign

43 Intégration des signaux dans le temps et l espace BaxterJExpBot

44 Enhanced HR cell death in transgenic tobacco plants expressing antisense RNA for capx. Ron Mittler et al. PNAS 1999;96: by National Academy of Sciences HR = «hypersensitive response» capx = peroxidase cytosolique Leakage = mort cellulaire progammé 44

45 Antioxidants and an inhibitor of ROI generation during the HR suppress bacteria-induced cell death in transgenic plants with reduced capx protein. Ron Mittler et al. PNAS 1999;96: DPI = inhibiteur de Rboh Asc, GSH = antioxydant by National Academy of Sciences

46 3-2 l'adaptation de la cellule aux stress oxydant (exemples) Etats pathologiques impliquant le stress oxydant chez l homme Pathologies Chroniques Pathologies Aigues 46

47 Les oxydations des LDL à l origine de l initiation de l athérosclérose. 47

48 Marqueur de peroxydation lipidique ISOPROSTANES 48

49 Relation entre facteur de risques de la maladie coronarienne et le taux d isoprostane Facteurs de risques Taux d Isoprostane élevé 49

50 4 Conclusion Anti-Oxydant Pro-Oxydant Helmut Sies (1985) Déséquilibre de la balance prooxydants/antioxydants en faveur des premiers qui entraîne des dommages oxydatifs des biomolécules Dean Jones (2006) Perturbation de la signalisation redox et une perte du contrôle de l homéostasie 50 redox

51 Lecture - «Chimie et biochimie radicalaires» C Houée-Levin, C Sicard-Roselli, J Bergès, Editions Belin «Molecular Biology of the Cell» Alberts et coll Garland Science 5th ed 51