Etude des interactions anticorps antigène et du rôle du macrophage dans la réponse immunitaire

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1 Groupe 1 BALLIANA Antoine BRESSE Claire DEPOUSIER Estelle ESPRABENS Loïc LE FLOHIC Swan MUIRAS Aude SCHOR Arthur Etude des interactions anticorps antigène et du rôle du macrophage dans la réponse immunitaire

2 Expérience 1 : Etude de la spécificité de l interaction anticorps antigène Un anticorps est-il spécifique à un antigène donné? On réalise le test d Ouchterlony. Préparation de la gélose : 100 ml de PBS + 1,5 g d agarose Réchauffement au microondes Dépôt au fond de boîtes de Pétri Solidification de la couche de gélose

3 A l aide d un emporte-pièce, on fait les trous dans la gélose. 5 : Eau 1 : Lysozyme 10 mg/ml Sérum souris immunisée (anticorps anti lysozyme) ou souris non immunisée (pas d anticorps anti-lysozyme) 2 : Lysozyme 1 mg/ml 4 : Ovalbumine 1 mg/ml 3 : Ovalbumine 10 mg/ml

4 On laisse en culture 24 heures dans un milieu humide.

5 Résultat du test d Ouchterlony Arc de précipitation entre le puits central contenant l anticorps anti-lysozyme et les puits 1 et 2 contenant du lysozyme. On n observe pas d arc de précipitation car le sérum de la souris non immunisée ne contient pas d anticorps anti-lysozyme. Conclusion : Un anticorps est spécifique à un antigène donné.

6 Expérience 2 : Etude du rôle du macrophage dans la réponse immunitaire La phagocytose est-elle plus efficace avec ou sans anticorps? On prépare deux plaques : la 1 ère avec des macrophages et la 2 ème avec des cellules CHO. Billes de latex + anticorps Billes de latex sans anticorps Macrophages Billes de latex + anticorps sans macrophage Billes de latex sans anticorps sans macrophage Billes de latex + anticorps Billes de latex sans anticorps Cellules CHO Plaque 1 Plaque 2 On centrifuge 5 min et on incube 20 min à 37 C.

7 On fait 4 lavages pour chaque puits. A l aide d un microscope (x 40), on compte les billes de latex à l intérieur des macrophages pour la 1 ère plaque, et à l intérieur des cellules CHO pour la 2 ème plaque. Macrophages avant l ajout des billes de latex Cellules CHO avant l ajout des billes de latex Macrophages après l ajout des billes de latex Avec anticorps Sans anticorps Cellules CHO après l ajout des billes de latex

8 nombre de macrophages Répartition du nombre de billes de latex phagocytées par macrophage selon la présence ou non d anticorps avec anticorps sans anticorps > 2 nombre de billes de latex phagocytées Conclusion : La phagocytose est plus efficace en présence d anticorps sur l antigène.

9 Expérience 3 : Etude du rôle du macrophage dans la réponse immunitaire Les macrophages sont-ils capables de phagocyter des microorganismes (levures)? Marquage des levures avec 2 colorants différents (un rouge et un vert) : On met 2 grains de levure dans de l eau. On prépare des tubes de 1,5 ml et on centrifuge 5 min. On chauffe le PBS à 37 C, puis les colorants mélangés avec le PBS. On enlève le surnageant au-dessus des levures. On rajoute 100 µl de colorant chauffé. On met dans un bain sec 15 min à 37 C. On centrifuge 5 min. On enlève le surnageant. On ajoute 200 µl de milieu de culture. On incube 30 min à 37 C.

10 Afin d enlever l excès de colorant, on lave les solutions 2 fois en centrifugeant 5 min avant chaque lavage. On prépare 2 plaques : la 1 ère plaque avec des macrophages et la 2 ème avec des cellules CHO. Dans chaque plaque : Puits 1 : 50 µl de levures colorées en vert Puits 2 : 50 µl de levures colorées en rouge Puits 3 : 25 µl de chaque type de levures Puits 4 : on n ajoute rien au milieu On incube 1 heure à 37 C.

11 On teste l efficacité de la coloration des levures avec les levures colorées préparées restantes. Observation au microscope (x 40) Marquage rouge

12 Marquage vert On compte les levures en lumière blanche et avec la fluorescence. On obtient une efficacité de 92 % pour les colorations verte et rouge.

13 On effectue 4 lavages pour chaque puits des 2 plaques. On observe au microscope (x 40) les levures phagocytées par les macrophages pour la plaque 1, et par les cellules CHO pour la plaque 2. Marquage vert Cellules CHO Conclusion : Les macrophages sont aussi capables de phagocyter des microorganismes, ici les levures.

14 Cinétique de la phagocytose des levures par les macrophages On prend des photos toutes les 10 min. t 0 sans les levures 10 min 20 min 50 min 40 min 30 min 60 min On constate que au fur et à mesure, de plus en plus de levures sont phagocytées par les macrophages.

15 Schéma bilan

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