Screening de résidus de pesticides par analyseur à temps de vol (ToF) : Mythe ou réalité?

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1 Screening de résidus de pesticides par analyseur à temps de vol (ToF) : Mythe ou réalité? Laure Joly et Vincent Hanot ISP, Rue Juliette Wytsman 14, 15 Bruxelles Passagers pesticides, c est le temps de se présenter au guichet de l aéroport Près de 8 pesticides sont actuellement répertoriés par l union européenne. A l heure d aujourd hui, le triple quadripôle en mode MRM (Multiple Reaction Monitoring) associé à la chromatographie liquide ou gazeuse est l analyseur le plus communément utilisé pour rechercher simultanément plusieurs centaines de molécules. Avec cet appareil, chaque pesticide potentiel est suivi par deux transitions MRM. Cependant, il se trouve que le nombre de pesticides à analyser conjointement est en constante augmentation, et que le nombre de transitions MRM n est malheureusement pas illimité. Néanmoins, des solutions alternatives aux analyses par triple quadripôle sont actuellement en développement. Parmi celles-ci, la plus plébiscitée reste sans conteste l analyseur de type ToF (Time of Flight) avec lequel on réalise un screening préalable à la quantification des pesticides. De plus, il s avère que ce type de spectromètre de masse réponde parfaitement aux nouveaux critères SANCO 12495/211 [1]. Enfin, en regard des dernières avancées réalisées par les constructeurs, il semble que ce soit plus que jamais le temps pour nos pesticides de... se diriger vers la porte d embarquement L analyseur à temps de vol (ToF) permet de connaitre le ratio masse sur charge (m/z) d un ion à partir du temps (t) nécessaire à celui-ci pour parcourir le tube de vol et atteindre le détecteur. Avant de pénétrer dans ce tube, les ions sont accélérés grâce à une différence de potentiel (U) de valeur connue. L énergie potentielle ainsi emmagasinée correspond à Ep = zeu, avec e, la charge élémentaire. Une fois dans le tube (de longueur L), les ions évoluant dans des conditions de vide poussé, leur énergie potentielle est totalement convertie en énergie cinétique : Ec = 1/2mv 2, avec v, la vitesse de l ion. Etant donné que Ep = Ec et v = L/t, il apparait que : m/z = t 2. Cste En pratique, cela signifie qu un ion présentant un ratio m/z égal à mettra deux fois plus de temps à parcourir le tube de vol qu un ion présentant un ratio m/z égal à 25. La théorie assimilée, il est maintenant temps de 28

2 se frotter au mur du son Plusieurs avancées technologiques ont successivement révolutionné le fonctionnement du ToF. Tout d abord, la mise en place d un réflectron (miroir ou réflecteur électrostatique) a permis de compenser les différences d énergie potentielle pouvant exister entre ions de même ratio m/z par une différence de longueur de parcours au sein même du réflectron et ce, afin de leur permettre d arriver ensemble au détecteur. Deuxièmement, le pusher. La source électrospray générant des ions de façon continue, il devient hasardeux de fixer un temps initial de référence (t = ) propre à chaque ion et marquant l introduction de celui-ci dans le tube. Afin de solutionner cet épineux problème, on ajoute aujourd hui un pusher. Par l application d une accélération orthogonale aux ions, ce dispositif, permet le regroupement en paquet de ces derniers à l entrée du ToF. De plus, cet ingénieux procédé permet également d éviter la présence des neutres. Pour terminer, on veillera à maintenir une pression extrêmement faible (~ bar) dans le ToF et ce, afin de prévenir toute fragmentation pouvant survenir par collision entre les ions accélérés et le milieu ambiant. Reflectron Detector Pusher Source Figure 1 : Trajectoire des ions dans un tube de vol, le réflectron compense les différences d énergie acquise avant l entrée dans le tube de vol : les ions bleu et rouge de même masse arrivent en même temps au détecteur 29

3 Avant de s envoler, réservons nous le temps de contacter la tour de contrôle L identification des pesticides se base en partie, dans le cas d un ToF, sur la masse moléculaire de l ion parent et non sur des transitions MRM parent-fragment comme cela serait le cas avec un triple quadripôle. Il est donc crucial de mesurer les masses avec exactitude lorsque l on utilise un analyseur ToF. Afin de s assurer que la masse mesurée soit la plus proche possible de la valeur théorique ; sensibilité, exactitude et résolution sont optimisées comme suit : Premièrement, les paramètres de fonctionnement de la source, du transfert et du ToF sont optimisés à l aide d un composé présentant une masse similaire à celles des pesticides à analyser. Deuxièmement, on réalise une calibration externe dans le but d obtenir une masse mesurée proche de la masse exacte en chaque point du spectre. De telles calibrations sont réalisées quotidiennement voire hebdomadairement selon le degré d exactitude recherché. Enfin, une calibration interne est effectuée en continu : un composé de référence dit lock mass est introduit dans la source conjointement aux analytes et ce tout au long de l analyse. Cette dernière étape permet de s affranchir des variations qui pourraient survenir au cours du temps (dues à l évolution de la température par exemple). Maintenant que les conditions de vol semblent optimales, prenons le temps d établir notre plan de vol Tout d abord, compte tenu du fait qu aucune sélection en masse préalable n est menée par l analyseur ToF, la totalité des ions générés au sein de la source sont détectés simultanément : la plupart des ions détectés sont ceux de la matrice. Le chromatogramme obtenu pour une matrice de mandarine ne contenant aucun pesticide est présenté à la figure 2. Avec un triple quadripôle, les mêmes ions sont générés dans la source mais l analyseur sert de filtre et ces ions ne sont pas détectés. Recueil de note du copilote La résolution représente la capacité de l analyseur à séparer deux composés de m/z voisins, et est donnée par R=m/δm. Une mesure de la résolution pour un ion isolé de masse (m) consiste à prendre sa largeur (δm) à mi-hauteur. L exactitude sur la mesure de m/z de la molécule analysée représente la faculté de mesurer une masse la plus proche possible de la masse théorique. Cette mesure doit être fidèle et juste. En spectrométrie de masse, l erreur de mesure (définissant l exactitude) est exprimée - soit en dalton (valeur absolue), erreur (Da) = M exp - M th - soit en partie par million (valeur relative), erreur (ppm) = M exp M th / M th * 1 6 3

4 Time (min) Figure 2 : Chromatogramme d une matrice de mandarine ne contenant aucun pesticide Enfin, l identification des pesticides est faite en s appuyant sur la haute résolution et la grande exactitude en masse de l analyseur ToF. La masse recherchée est la masse monoisotopique correspondant au premier pic du profil isotopique. Ce pic ne prend en compte que les masses des isotopes les plus stables (figure 3). Pour comparaison, avec un triple quadripôle, les masses recherchées sont les masses moyennes des ions. Figure 3 : en noir, la masse théorique moyenne du cyprodinil et en violet sa masse monoisotopique théorique Monoisotopic mass Average mass m/z 31

5 Après ces quelques considérations, c est le temps d un vol essai Lors d une analyse avec un ToF, un logiciel compare les masses monoisotopiques théoriques (M th ) de chaque pesticide avec les différentes masses du spectre de masse (M exp ), une tolérance de 5 à 1 ppm est généralement acceptée. A partir du chromatogramme total d un échantillon de mandarine (figure 4a), la présence du cyprodinil est confirmée au temps de rétention chromatographique de 8.38 min en extrayant le chromatogramme correspondant à sa masse monoisotopique théorique ( ) avec une tolérance de 1 ppm (figure 4b). Figure 4 : (a) chromatogramme d un échantillon de mandarine, (b) chromatogramme du même échantillon filtré pour la masse (masse théorique du cyprodinil) avec une tolérance de 1 ppm a) 1: TOF MS ES+ BPI 1.2e : TOF MS ES PPM 1.42e3 b) Time (min) Le spectre de masse associé au temps de rétention 8.38 min se trouve à la figure 5a. Les logiciels de traitement permettant de soustraire le bruit de fond sont d une grande utilité pour identifier un pesticide au milieu d une foret de masse (figure 5b). 32

6 SG (8.421) Cm (2153:2191) 4.78e4 1.19e4 a) SG (8.421) Cm (2152:2191-(2128: :2217)) b) m/z m/z Figure 5 : spectres de masse associés au temps de rétention 8.38 min sans (a) et avec (b) soustraction du bruit de fond Après ce baptême de l air réussi, il est temps d effectuer un vol long courrier Lors d un screening, plusieurs centaines de pesticides sont recherchés : la paire temps de rétention connu / masse monoisotopique théorique de chaque pesticide est sondée. Les étapes précédentes sont répétées de façon automatique ou semi automatique plusieurs centaines de fois. Cependant, les différents voltages de source (capillaire, cône) et de transmission d un ToF ne peuvent pas être individualisés. En effet, à l inverse de ce qui se passe avec un triple quadripôle; avec un ToF, des conditions génériques moyennes sont appliquées pour l ensemble des pesticides. Chaque voltage non optimal pour un pesticide donné diminue en conséquence ces chances d arriver intact au détecteur. Il suffit d un voltage imparfait pour que le pesticide soit mal ionisé, soit fragmenté ou ne soit pas transmis. Un petit décalage dans la calibration suffit également pour que le pesticide sorte de la zone de tolérance de 1 ppm et que celui-ci ne soit pas repéré par le logiciel. Ces décalages arrivent lorsque l intensité du signal est trop faible : la forme du pic est mal définie et l exactitude de la masse diminue mais également lorsque le signal est trop intense : une saturation du détecteur entraine une déformation du pic et un décalage en masse a lieu. Une perte de la calibration au cours du temps ou un aveuglement momentané du détecteur par un pic de matrice extrêmement intense peuvent également entrainer des problèmes d exactitude en masse. Les matrices dans lesquelles des pesticides sont recherchés sont extrêmement variées et influencent chacune à leur façon l ionisation, la transmission et la détection des pesticides : une perte de sensibilité drastique peut être observée avec une matrice particulière pour un pesticide donné sans que les analyses précédentes dans d autres matrices n aient pu laisser présager un tel problème. La vitesse de scan va elle aussi influencer la sensibilité : plus elle est lente, plus la sensibilité de l appareil augmente mais en contre partie le nombre de point par pic diminue ce qui affecte le logiciel de déconvolution et donc l exactitude en masse. Les différents constructeurs mettent tout en œuvre pour améliorer en parallèle la sensibilité, la résolution et l exactitude sur les ToFs de nouvelle génération. Mais l œil critique de l analyste sera toujours nécessaire pour éviter les faux positifs et faux négatifs avec un ToF. Un faux positif n est en soit pas un problème puisque la confirmation pourra infirmer ce résultat par contre un faux négatif n aura pas de deuxième chance. C est la fin du voyage, il est temps d 33

7 atterrir en douceur En conclusion, le ToF est un outil extrêmement performant basé sur un principe simple : mesurer le temps de parcours d un ion pour connaitre sa masse. La haute résolution, la grande exactitude et la sensibilité élevée de ces appareils permettent de s appuyer uniquement sur la mesure de la masse mono isotopique du pesticide pour son identification. En contre partie il faut toujours garder un esprit critique sur les résultats au regard de tous les aléas pouvant arriver aux pesticides que ce soit à l étape d extraction et de purification, à l étape de chromatographie et de détection ou encore à l étape du traitement des résultats par le logiciel. Heureusement, les différents gardes fous repris dans les critères SANCO sont à même d empêcher les principales sources d erreurs (faux positifs et faux négatifs). L analyste doit démontrer sa capacité à détecter le pesticide à la limite de détection (SDL, screening detection limit) dans au moins 95 des échantillons. Aujourd hui, au niveau Européen, plusieurs laboratoires utilisent la technologie du ToF pour effectuer les analyses de screening en routine. Carnet de bord [1] SANCO 12495/211 Method validation and quality control procedures for pesticide residues analysis in food and feed Laure.Joly@wiv-isp.be 34