Séquences hautement répétées chez les plantes supérieurs

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1 Séquences hautement répétées chez les plantes supérieurs Groupe5 Réaliser par : ELOUARDY Hicham. EL MAKNI Mohamed. BOUSSIF Soufiane. GHARIB Imaddine. EL OUAARABI Rachid. ELBAKKAL Salah Eddine. ELALLAOUI Abdellali.

2 SOMMAIRE Introduction : I. Extraction de DNA totale de plantes : 1. Objectif : 2. Méthode expérimentale : II. Préparation du gel d agarose : 1. Objectif : 2. Etapes de préparation du gel : III. Analyse qualitative et quantitative du DNA natif : 1. Objectif : IV. Hydrolyse par endonucléase de restriction : 1. Objectif 2. Observation : 3. Interprétation : 4. Déduction : V. Electrophorèse : 1. Objectif : 2. Principe : 3. Protocole : VI. Analyse de documents : 1. Principe d extraction de type «southern» 2. Interprétation : Conclusion :

3 Introduction : Les séquences répétées, ou répétitions sont une des clefs de voûte de l évolution des génomes. Elles sont la marque d un processus continu de duplications et de réarrangements des chromosomes de toutes les espèces. Une répétition sera définie, comme une séquence d'adn présente sous des formes similaires au moins deux fois dans un génome. Cette similarité est caractérisée par un pourcentage d'identité entre les copies. L'ADN n'étant constitué que de quatre bases différentes (Adénine, Cytosine, Guanine et Thymine), il faut envisager que de nombreuses répétitions apparaissent par de simples mutations ponctuelles. Les plus simples répétitions rencontrées dans les génomes sont constitués de Ces répétitions sont extrêmement répandues dans les génomes animaux et végétaux, elles résultent, en majorité, de l invasion du génome par des éléments transposables et des rétrovirus endogènes, séquences ayant la capacité de se multiplier. Ce n est que très récemment que les mécanismes de contrôle des séquences répétées ont commencé à être découverts. Conservés au cours de l évolution, ils ont été mis en évidence chez les plantes, les champignons et les mammifères. Nous limiterons ce TP dans le cas des plantes: il s'agit de 4 plantes : deux crucifères et deux cucurbitacées. La mise en évidence des séquences nécessite la familiarisation avec un certain nombre de techniques de manipulation des acides nucléiques dont on peut citer l'électrophorèse Les échantillons étudiés :

4 Le chou-fleur la courgette la courge rouge le chou Objectif du TP: Il s agit de la mise en évidence des séquences hautement répétées en série chez les plantes tout en améliorant nos connaissances en techniques de laboratoire : extraction du DNA total de plantes et analyse qualitative et quantitative de ce dernier I. Extraction de DNA totale de plantes : 1. Objectif : le but de cette manipulation est de se familiariser avec une des techniques les plus importantes de l extraction du DNA chez les plantes en utilisant un détergent qui permettra de faire précipiter l ADN (CTAB : cétyltriméthylammoniumbromide ) 2. Méthode expérimentale : l échantillon végétal est réduit en poudre à l aide de l azote liquide puis ajouté de tampon d extraction puis incubé au bain marie la séparation du DNA des débris cellulaires se fait à l aide du chloroforme qui permet après centrifugation de distinguer entre deux phases :la supérieure aqueuse contenant les acides nucléiques et l inférieure organique. Après centrifugation on observe un précipité au fond du tube (culot) quand doit dissoudre dans 50μl d eau distillé

5 II. Préparation du gel d agarose : 1. Objectif : Préparation d un gel à base d agarose servant à la séparation des acides nucléiques au cours de l électrophorèse 2. Etapes de préparation du gel d agarose : a) Mélanger tampon TBE (350ml) et agarose (0,8g) b) Faire fondre l'agarose au four à micro-ondes en surveillant pour éviter les projections ou au bain marie. Agiter de temps à autre pour homogénéiser le mélange. c) Vérifier que l agarose est bien fondue. d) Laisser refroidir jusqu'à ce qu il devienne possible de saisir le flacon à main nue. e) Placer les joints fournis avec la cuve pour fermer le support de gel et positionner le peigne à 1 mm du fond et à environ 1 cm de l extrémité du support. Régler le niveau pour que le support de gel soit horizontal. Certains peignes sont réglables avec une vis : il y a alors une cale pour régler leur hauteur. D autres sont pré-adaptés au support et ne nécessitent pas de cale.

6 f) Couler lentement le gel sur 3 à 5 mm d'épaisseur en veillant à ce qu il entoure bien les dents du peigne. g) Laisser refroidir, enlever le peigne et les joints. Le gel est prêt pour le dépôt des échantillons. Fermer la cuve, brancher les fils et mettre sous tension. Laisser migrer à voltage constant pendant environs 2h. Le voltage utilisé est de 100 V. III. Analyse qualitative et quantitative du DNA natif 1.Objectif : L objectif de cette expérience est estimer la qualité et la quantité des ADN extraits. N.B : Notre échantillon est C: Courge rouge.

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8 PROFIL ELECTROPHORETIQUE DE 28 PUITS Calcul de la quantité de DNA correspondant aux bandes observées dans les échantillons étalons : Puits 23 : Pour le vecteur : pour l insert : 10ng 4100pb 10ng 4100pb X 2900pb Y 1200pb X=7,07ng Y=2,93ng

9 Puits 24 : Pour le vecteur : pour l insert : 20ng 4100pb 20ng 4100pb X 2900pb Y 1200pb X=14,15ng Y=5,85ng Puits 25 : Pour le vecteur : pour l insert : 40ng 4100pb 40ng 4100pb X 2900pb Y 1200pb X=28,29ng Y=11,71ng Puits 26 : Pour le vecteur : pour l insert : 60ng 4100pb 60ng 4100pb X 2900pb Y 1200pb X=42,44ng Y=17,56ng Puits 27 : Pour le vecteur : pour l insert :

10 80ng 4100pb 80ng 4100pb X 2900pb Y 1200pb X=56,58ng Y=23,42ng Puit28 : Pour le vecteur : pour l insert : 100ng 4100pb 100ng 4100pb X 2900pb Y 1200pb X=70,73ng Y=29,26ng Calcul de la Quantité d ADN dans les échantillons végétaux : La courgette : La quantité d ADN présente dans le puits 18 est la même dans le vecteur 26 (même intensité de bandes) donc : En multiplie par le facteur de dilution : 5*42, 44=212,2ng 212,2ng 8µl X 50 µl X = 1326ng Courge rouge: La quantité d ADN dans le puits14 est la même dans l insert 26 :

11 5*5*17, 56=439 ng 439ng 8µl X 50 µl X= 2743ng Le chou: La quantité le DNA dans le puits 8 est la même dans le vecteur 27 : 5*56, 58=282,9ng 282,9ng 8µl X 50 µl X= 1768,12ng Chou -fleur: La quantité de DNA présente dans le puits 5 est la même dans le vecteur 27 : 5*5*5*56, 58=7072, 5ng 7072, 5ng 8µl X 50 µl X= 44203, 12ng

12 Plante Chou-fleur Chou Courge rouge Courgette Quantité d ADN en ng , ,12ng 2743ng 1326 IV. Hydrolyse par endonuclèase de restriction : 1.Objectif : Le but est de mettre en valeur le rôle d une enzyme (Hind III) dans la détection des séquences répétées en série chez 4 plantes Mg ++ NNNN AAGCTTNNNN 2HϩO NNNNA AGCTTNNNN NNNNTTCA ANNNN NNNNTTCGA + ANNNN ADN à double brin ADN Digéré Schéma illustrant l enzyme de restriction HIND III

13 PROFIL ELECTROPHORETIQUE DE 16 PUITS 2.Observation : Les marqueurs utilisés ont des poids moléculaires(pm) allant de 250 à Pb (paires de base) dans les deux séries. Dans serie1 (RNase A+Hind III) on observe une seule bande sur chacun des puits 4 et 5 ayant le même PM inférieure à 250 Pb, mais avec une intensité différente (la bande du puits 4 étant plus intense

14 que celle du puits 5). Le puits 6 ne contient aucune bande.au niveau du puits 7 on observe 3 bandes la première qui est plus intense que les deux autres à un PM inférieur à 500pb la deuxième à un PM d environ 750pb et plus intense que la dernière ayant un PM supérieur à 1000pb. Dans la série2 (Hind III) on observe dans chaque puits une très forte intensité à la fin de migration. Celle-ci camoufle les bandes des puits (<250pb) 11 et 12 qui ne sont donc plus visibles. Le puits 13 ne contient aucune bande sauf l intensité à la base. Le puits 14 contient 3 bandes ayant les mêmes PM et des intensités identiques au puits 7 de la série1 3. Interprétation : En ce qui concerne la serie1 la présence de bandes dans les puits 4 ; 5 ; 7 montrent qu il y a eu des coupures par l endonucléase de restriction Hind III au niveau de leur DNA par contre, sur le puits 6 il n ya pas eu de coupure par celle-ci car on n a pas eu de bandes, ceci peut s expliquer par le faite que sur le puits 6 la Hind III n a pas pu trouver de sites de restriction dans ce cas soit ces sites n existent pas ou ils ont été muté. Les puits 4 et 5 possèdent chacun une seule bande ce qui indique que les morceaux de DNA obtenus après coupure ont la même taille cela signifie que la Hind III à coupé au niveau sites de restriction disposés à la même distance. L intensité diffère dans les deux puits car il y a une quantité de DNA plus importante dans le puits 4 que le puits 5.Dans le puits 7 il y a 3 bandes ce qui montre que les morceaux de DNA obtenus après coupure n ont pas la même taille donc certains sites ont été mutés. La série 2 présente une forte intensité (<250pb) à la fin de la migration dans tous les puits, ceci traduire la présence du RNA dans ceux-ci due

15 à l absence RNase A, qui dégrade tout le RNA présent dans les tubes correspondant. Ce RNA camoufle les bandes des puits 11 et 12, qui ont un PM<250pb semblable à celui du RNA, qui possède par contre une intensité plus forte. Par conséquence l apparition de grande tache de RNA perturbe l apparition des séquences de DNA des puits 11 et 12.Quant au puits 13 l interprétation reste la même.le puits 14 possède toujours ces 3 bandes vu que le PM du RNA est inférieur à celui des bandes. 4. Déduction: La première, on a une migration de DNA aussi bien que de RNA d ou la migration de ce dernier (possède simple brin) est plus vite que DNA (possède double brin), par conséquence il y a apparition d une grande tache qui perturbe l apparition des séquences de DNA. La deuxième, il y a absence de RNA, et cela due à l effet de RNase A qui détruit le RNA et cela permet l observation des séquences de DNA présente. 2 Electrophorèse : 1. Objectif : La séparation des ADN des échantillons utilisés lors de ce TP, en fonction de leurs tailles, utilisant une coloration au BET et une exposition à la lumière UV. 2. Principe : Technique de séparation par un champ électrique des molécules chargées (acides nucléiques, protéines...). Un mélange de protéines est soumis à un champ électrique, les protéines chargées négativement

16 migrent vers la cathode, les protéines chargées positivement migrent vers l anode. La distance parcourue par un type de molécule en un temps donné dépend de sa charge globale et de sa masse moléculaire. Les protéines ou les fragments d acides nucléiques forment alors des bandes qu il est possible de caractériser par des techniques appropriées (réaction de coloration, sonde radioactive...).. 3. Protocole : Placer les échantillons d ADN pendant 3 min à C. Les transférer sur de la glace pendant 2-3 min. Ces deux opérations sont destinées à empêcher la ligation de fragments possédant éventuellement des extrémités cohésives. Pour le remplissage de puits de mm de large bien adaptés à un usage pédagogique, une proportion de 5 µl de colorant de charge pour 10 à 15 µl d ADN convient (de façon à obtenir de 1 à 4 µg d ADN par puits). 1. Mélanger le colorant de charge et l ADN sur un morceau de parafilm et prélever le mélange avec une micropipette réglée sur le volume approprié en changeant de cône à chaque prélèvement. 2. Remplir les puits en faisant attention de ne pas déchirer le fond du gel avec la pointe de la pipette. 3. Placer le support avec le gel chargé dans la cuve d'électrophorèse en positionnant les puits du côté de la cathode (pôle noir). 4. Remplir la cuve de tampon TBE (réutilisable plusieurs fois) en versant délicatement et très lentement lorsque le gel commence à être recouvert pour éviter les fuites d ADN vers le tampon. 5. Fermer la cuve, brancher les fils et mettre sous tension. 6. Laisser migrer jusqu à ce que le colorant de charge arrive à proximité du bord du gel (environ 55 min à 100 V pour un gel de 80 mm dans une mini cuve).

17 7. Couper l alimentation, débrancher les connections et récupérer le gel dans son support. I. Analyse de documents : 1. Principe d extraction de type «southern» Elle est basée sur l hybridation de fragments de DNA avec une sonde complémentaire. Les fragments résultants de la restriction par Hind III sont soumis à une électrophorèse sur gel d agarose avec utilisation d un tampon, puis on les fixe sur une membrane de nylon et ensuite on les fixe aux molécules d une sonde radioactive complémentaire ; après on utilise un film radiographique destiné à être impressionné par la sonde, le résultat est représenté par un nombre de taches noires chacune a une distance de migration précise 2. Interprétation : Document 1 :. Après avoir traité le DNA du chou-fleur par l enzyme de restriction Hind III, Cet enzyme qui possède un seul site de coupure par unité de répétitivité au sein de la famille de séquence répétées qu on veut mettre en évidence. L hydrolyse partielle nous montre plusieurs bandes de poids moléculaire différents donc les séquences de restriction ne sont pas toutes hydrolysées. Par contre, l hydrolyse totale nous donne trois bandes bien distinctes. Dans le cas de l hydrolyse partielle l enzyme n a pas eu le temps suffisant pour effectuer le maximum de coupure, entre temps pour l hydrolyse totale l enzyme a eu le temps nécessaire la présence de trois prouve que tous les sites n ont pas été coupé cela pourrait être expliqué par la présence de mutations au niveau de ceux-ci. Autrement dit, pour l hydrolyse totale en ce servant du DNA

18 utilisé comme sonde radioactive, qui est un monomère 177 paires de bases (Pb), on remarque que la bande qui migre le plus loin correspondant à 177pb, la deuxième à 354pb est la troisième à 531pb. Par la suite deux possibilités se posent ; si une région de DNA est formée seulement d une séquences hautement répétée, l enzyme de restriction va donnée les plus petites fragments possibles qui migrent à la plus grandes distances de poids moléculaires (PM)=177pb ; ou si les séquences hautement répétée ne sont pas reconnus par l enzyme de restriction, dans ce cas on obtient des fragments plus grand qui migrent moins avec des PM =354pb ou = 531pb D après cette analyse nous déduisons que le DNA de chou-fleur possède une séquence hautement répétée avec un seul site de restriction qui donne un fragment de PM= 177pb. document2 :. Le traitement de DNA a été réalisé par deux enzymes ; MspI, Hpa qui ont une particularité de couper au niveau de la cytosine, selon les conditions suivantes : Si : Les 2 cytosines sont méthylés les 2 enzymes ne coupent pas Les 2 cytosines ne sont pas méthylés la cytosine interne est méthylés La cytosine externe est méthylé les 2 enzymes coupent MspI coupe, HpaII ne coupe pas. HpaII coupe,mspi ne coupe pas Dans la première expérience on remarque la présence de plusieurs bandes de tailles différentes et de grand PM après action l enzyme

19 MspI. L observation de plusieurs bandes indique que soit le DNA n est pas méthylé, ou bien il est méthylé au niveau de la cytosine interne.les PM élevés des bandes sont due à l inaccessibilité des sites de restriction par les enzymes ceci pouvant s expliquer par l enroulement du DNA de la chou fleur. A partir de la deuxième expérience par HpaII, on obtient aucune bande ce qui indique la présence d une méthylation de cytosine interne. En conclusion le DNA de chou-fleur méthylé au niveau de la cytosine interne, et le site de restriction de MspI et HpaII est le même, même si ces derniers sont inhibés par la méthylation. Conclusion : Le TP nous a permis de mettre en évidences l ensemble des résultats suivant : L hydrolyse par Hind III et l électrophorèse nous a montré la présence d un ensemble de séquences répéter au niveau du DNA étudier qui ne sont pas codante, donc ils peuvent subir des mutations. La présence de taches en continuité permet de déduire que les séquences répétées en série ont des tailles très rapproché. Les échantillons contenant Hind III seulement avaient migré plus loin par rapport a ceux qui contiennent la RNA ase cela est due au Faite que l ARN est plus léger que l ADN. L existence de ressemblances au sein de même famille plus précisément au niveau de séquences répétés en tandem de DNA.

20 Références : iw=1280&bih=656&um=1&ie=utf-8&tbm=isch&source=og&sa=n&tab=wi&ei=vgwwt5q0 NqnC0QXfp4GsCQ Dictionnaire de SVT, Michel Breuil, Nathan, 1997.