REGARD SUR LA BIOCHIMIE

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1 Enseignement : La biochimie est-elle plate? Comme les européens d avant Christophe Colomb, j ai parfois l impression que la biochimie et la biologie moléculaire que nous enseignons aujourd hui sont plates. Nos manuels de référence donnent souvent l image d une science bornée, close, terminée. C est une accumulation de chapitres sur le métabolisme, les mécanismes et les grands processus moléculaires de la vie que les étudiants de premier cycle trouvent en général indigeste, rébarbative voire même dépassée. Certains grands classiques, comme le cycle de Krebs, sont même considérés comme des épouvantails, l exemple même d un savoir peu utile et inintéressant, qu on est obligé d apprendre par cœur, pour mieux l oublier aussitôt. Pourtant notre discipline est vivante, elle raconte des histoires, celle de l ingéniosité de la Nature et de l Evolution, mais aussi celle des biologistes qui l ont découverte. Le cycle de Krebs ou la réplication de l ADN sont des exemples magnifiques. La manière dont les cellules vivantes ont domestiqué la combustion du glucose C 6 H 12 O O 2 -> 6 CO H 2 O pour produire de l énergie chimique reste un miracle d optimisation. L expérience de Reiji Okazaki et de sa femme Tuneko pour mettre en évidence la réplication discontinue du brin lent de l ADN est une merveille d intuition et d interprétation, réalisée avec des outils incroyablement simples. Je suis toujours époustouflé en la relisant, plus de 40 ans après (Okazaki et al PNAS 59:598, librement accessible en ligne) A vouloir faire plus, on fait souvent moins bien. Je pense que les programmes pédagogiques actuels Editorial...1 Vie de la Société (Elections)...2 Actualité (Micro-ARN et prozac ; protéines flexibles).3 Actualité (l ARNIII de S. aureus)...4 Actualité (Sphingosine-1p et tumeurs)...6 Actualité (Protéines fluorescentes et microscopie)...8 Actualité (L ARNtm-SmpB dans le ribosome )...9 Pratique...11 sont trop vastes, des catalogues de mécanismes survolés à vive allure comme on zappe sur sa télévision. Ceci interdit l approfondissement, la réflexion et la mise en perspective de la démarche expérimentale, qui sont les bases de la réflexion scientifique. Le bourrage de crâne des premières années délivre une image plate de l état de la connaissance, qui éveille peu l intérêt de l étudiant et surtout aucun esprit critique. La réflexion scientifique nait de la combinaison de la curiosité et du doute. Si nous voulons continuer à éveiller des vocations et de l intérêt pour nos disciplines, il faut balayer devant nos portes et réfléchir à leur enseignement. Notre Société doit jouer un rôle dans cette réflexion, nos membres étant presque tous engagés dans la formation initiale ou par la recherche. L année 2011 doit être l occasion de redonner du «relief» à la biochimie et à la biologie moléculaire. La SFBBM va engager une réflexion auprès des acteurs du domaine et vous allez en être destinataires. J en profite donc pour former des vœux pour la Société et pour tous ses membres en cette nouvelle année Qu elle vous soit heureuse et propice. Frédéric Dardel RSB - décembre

2 Vie de la Société Elections pour le renouvellement partiel du conseil d administration de la Société française de biochimie et biologie moléculaire. En application du règlement intérieur, il sera procédé, en 2011, à l élection de deux membres du conseil d administration de la SFBBM. Le vote se fera par voie électronique. Candidature à un poste d administrateur Olivier Cuvillier Institut de Pharmacologie et Biologie Structurale, UMR 5089 du CNRS 205 route de Narbonne Toulouse Cedex 4 Benoit Schneider Laboratoire Cellules souches, Signalisation et Prions, U747 de l INSERM Université Paris Descartes 45 rue des Saints Pères Paris Marie Sisler Architecture et Réactivité de l arn, UPR 9002 du CNRS 15 rue René Descartes Strasbourg Cedex APPEL A COTISATION 2011 Votre fidélité est garante de notre action. Nous vous remercions de nous apporter votre soutien en réglant dès à présent votre cotisation 2011 (déductible pour moitié de l impôt sur le revenu) Groupe de réflexion AFSI : Association pour les Femmes en Science et en Ingénierie. La voie vers l égalité des chances des hommes et des femmes a commencé à se construire en Europe il y a quelques décennies, mais il reste du chemin à parcourir. Ainsi, bien qu il y ait dans l Union européenne de plus en plus de femmes diplômées, ceci ne se traduit pas par une augmentation proportionnelle dans les échelons supérieurs des instances scientifiques. On constate, à presque chaque congrès de haut niveau comme ceux de la FEBS, de l IUBMB ou d autres, que le nombre de femmes conférencières est faible. C était clairement le cas au congrès de l IUBMB à Shanghai en De ce point de vue, le congrès de la FEBS à Gothenburg en 2010 a été bien meilleur, je dirais exceptionnel (autour de 27 % de femmes conférencières, séances plénières et symposiums confondus). La science et l innovation ont constamment besoin d idées nouvelles, donc de l apport de divers types de personnes. Il est important de s assurer que tous les acteurs potentiels peuvent contribuer au développement de la science. Ceci implique que le talent des femmes soit aussi pris en considération, ce qui n est pas réellement le cas à ce jour. Ceci est un vrai problème auquel les sociétés savantes, les universités et d autres ont commencé à s intéresser. Ainsi la FEBS possède un groupe de travail (Women in Science and Engineering, WISE), qui s intéresse au manque de visibilité des femmes en science ( Au Royaume-Uni, l Université de Cambridge a développé le projet Women in SET Initiative ( pour favoriser les carrières des femmes et améliorer leur visibilité. GenSET ( et Portia Ltd. London ( poursuivent des objectifs similaires. En France existe une association Femmes & Science ( membre de l European Platform of Women Scientists et en Espagne, l association AMIT (Asociación de Mujeres Investigadoras y Tecnólogas) ( Un système de recherche qui veut être compétitif ne peut pas ignorer les femmes. La solution du problème n est pas facile parce qu il s agit d un phénomène complexe, qui a ses racines dans l histoire de l humanité, dans les inégalités au niveau de la famille et qui va plus loin que le domaine de la recherche. Dans ce contexte, il m a paru nécessaire de créer un groupe de réflexion, l AFSI, destiné à contribuer au débat au niveau européen et à identifier et promouvoir de jeunes femmes scientifiques de grande qualité. Il vient d être intégré à la SFBBM en tant qu activité transversale. Plusieurs femmes de haut niveau ont répondu positivement à l appel. Une des raisons pour lesquelles les femmes sont souvent reléguées à un deuxième plan est qu elles ont des difficultés à faire partie des réseaux d influence. L AFSI pourrait contribuer à mettre en place ce type de réseau. Dans cet ordre d idées, l AFSI accueille, bien évidemment, aussi des hommes, et il y en a. L AFSI pourrait contribuer à identifier des conférencières potentielles de qualité, et à les promouvoir, et contribuer aussi à l élaboration d une politique au niveau de la FEBS (groupe WISE) et de l IUBMB. Toute idée à propos de ce sujet sera la bienvenue. Une page web existera bientôt. María Luz Cárdenas (Coordinatrice groupe AFSI) 2 RSB - décembre 2010

3 Actualités scientifiques REGARD SUR LA BIOCHIMIE Le micro-arn 16: un relai de l action thérapeutique du Prozac Le transporteur de la sérotonine (SERT) recapte la sérotonine libérée par les neurones sérotoninergiques. Le SERT est la cible des antidépresseurs de la classe des inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine (SSRI) comme le Prozac. La découverte d un micro-arn, mir-16, qui contrôle négativement la synthèse du SERT a permis de dévoiler une chaîne de réactions déclenchée par le Prozac qui contribue à pallier le déficit de sérotonine chez les patients déprimés. Dans le cerveau, le SERT présent sur les neurones sérotoninergiques du raphé est le point d entrée de l action des inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine. Les neurones Modèle de la structure de l isomère S de la noradrénergiques du fluoréxine (Prozac) locus coeruleus expriment les ARN messagers du SERT mais un niveau élevé du micro-arn mir-16 bloque leur traduction. Dans le raphé, le Prozac provoque une augmentation de mir- 16 associée à une baisse de cinquante pour cent du nombre de molécules de SERT. Il cause aussi la libération d une protéine neurotrophique S100 b. Via les connexions raphé-locus coeruleus, ce signal S100 b fait chuter le niveau de mir-16 dans le locus. Les neurones noradrénergiques expriment de novo le SERT à partir des ARN messagers dormants et deviennent sensibles au Prozac. De plus, ils acquièrent les autres fonctions sérotoninergiques et notamment la capacité de synthétiser la sérotonine. Le Prozac crée donc une nouvelle source de sérotonine dans le cerveau. Le délai d action des antidépresseurs (environ 3 semaines) indique qu ils mobilisent des mécanismes d adaptation des neurones qui restaient jusqu alors totalement énigmatiques. Ces travaux révèlent comment les antidépresseurs alimentent un dialogue entre le raphé et le locus coeruleus et mobilisent la plasticité des neurones noradrénergiques pour exercer leur action thérapeutique. Anne Baudry Travaux récents Pour en savoir plus : mir-16 Targets the Serotonin Transporter: A New Facet for Adaptive Responses to Antidepressants Anne Baudry, Sophie Mouillet-Richard, Benoît Schneider, Jean-Marie Launay, Odile Kellermann. Science, 17 septembre 2010, vol. 329, n Communiqué de presse INSERM : Observer avec un nouvel œil la structure des protéines et leur flexibilité. Les structures tridimensionnelles des protéines sont le support de leurs fonctions biologiques. Pour mieux comprendre les règles gouvernant l état replié et donc à terme prédire cet état à partir de la séquence, une description fine de ces structures est nécessaire. Celles-ci sont souvent représentées à l aide des structures secondaires, les hélices a et les feuillets b, laissant 50 % des résidus affectés à des états non précisément caractérisés, les boucles. Cette simplification ne permet pas de reconstruire la structure globale. Une vision nouvelle a donc émergé, les alphabets structuraux, ensemble de petits fragments protéiques prototypes qui permettent d approximer l ensemble des structures locales des protéines. Nous avons développé un tel alphabet, utilisé avec succès pour l alignement des structures ou l analyse des contacts [1]. Une méthode de prédiction de ces prototypes, couplant données évolutives et algorithme d apprentissage sophistiqué, a aussi été élaborée qui atteint un excellent taux de prédiction [2]. Associé à cette prédiction, un indice de confiance a été proposé. Une question néanmoins demeure, concernant l origine des désaccords. S agit-il d erreurs ou bien les états prédits ne pourraient-ils pas représenter des états conformationels alternatifs liés à la flexibilité intrinsèque de la protéine? Nous avons donc abordé l étude de la flexibilité en utilisant conjointement des données issues de la cristallographie et de simulations de dynamique moléculaire (voir Figure 1). Nous avons choisi de prédire la flexibilité en trois états, rigide, flexible et intermédiaire. Outre l efficacité de la méthode de prédiction, cette recherche a montré que: (1) les facteurs B et RMSf des résidus d un ensemble de protéines ne sont pas très corrélés, mais les facteurs B et RMSf des prototypes représentant des structures locales, eux, le sont ; (2) les feuillets sont assez rigides (prototype 9), les boucles plutôt flexibles (prototype 120), mais les prototypes hélicoïdaux vont de très rigides à très flexibles (prototype 43) ; (3) les zones associées à des taux de prédiction faibles sont en fait des zones flexibles [3]. Alexandre G de Breven (prix Maurice Nicloux 2009) INSERM UMR S665 - DSIMB - Université Paris Diderot et Institut national de transfusion sanguine, Courriel du secrétariat de la SFBBM : Joseph A.P., Agarwal G., Mahajan S., Gelly J.-C., Swapna L.S., Offmann B., Cadet F., Bornot A., Tyagi M., Valadié H., Schneider B., Etchebest C., Srinivasan N., de Brevern A.G. (2010) Biophysical Reviews 2, Bornot A., Etchebest C., de Brevern A.G. (2009) Proteins 76, Bornot A., Etchebest C., de Brevern A.G. (2011) Proteins (sous presse). RSB - décembre

4 Le point sur... L ARNIII de Staphylococcus aureus et ses multiples facettes Une diversité d ARN régulateurs bactériens L ARN, au même titre que les protéines, est un acteur essentiel de la régulation de l expression des gènes bactériens. On peut estimer que près de dix pour cent du génome exprimerait des ARN non codants, appelés sarn [1] de taille variant entre cinquante et six cent nucléotides. Leur synthèse est régulée en réponse à un stress, à des perturbations de l environnement (température), au système de densité cellulaire ou à l hôte (virulence). L une des découvertes majeures de cette décennie est l identification de régions régulatrices qui agissent en cis. Ces sarn, fortement structurés, sont localisés dans les régions 5 non codantes des ARN messagers. Leur structure est capable de détecter un changement de concentration intracellulaire d un métabolite (riboswitch), ou une variation de température (thermosenseur), induisant un changement de conformation affectant l expression des gènes localisés en aval. Ces sarn régulent près de cinq pour cent des gènes du métabolisme de Bacillus subtilis [2]. Une autre classe prédominante de sarn régule l expression des gènes par appariements de base avec leurs ARN messagers cibles dont ils répriment ou activent la traduction et/ou affectent leur stabilité. On en dénombre plus d une centaine chez Escherichia coli et Salmonella typhimurium [3]. Ces sarn qui agissent en trans forment des appariements imparfaits avec leurs ARN messagers cibles, et régulent de manière coordonnée de multiples ARN messagers (plus de dix) qui codent pour des protéines aux fonctions reliées : protéines du métabolisme du fer, transporteurs et protéines membranaires, ou bien facteurs de virulence [1]. De plus, certains ARN messagers agissent comme régulateurs de la stabilité des sarn, rendant difficile la distinction entre la «proie» et le «prédateur» [4]. Ainsi ces sarn sont à l origine de réseaux complexes de RNAIII H13/H7 Actualités scientifiques Quorum sensing AgrC Régulation indépendante de l'arniii I Active - PSM II SD H14 ribosome 5' AUG 3' rot mrna P AgrA? sarn comme étant l effecteur intracellulaire du système de densité cellulaire codé par l opéron agr accessory gene regulator [5] (figure ci-dessous). Ce système de densité cellulaire, qui établit la communication entre cellules, est requis pour répondre aux variations de l environnement et pour la virulence. S. aureus est un pathogène opportuniste majeur de l homme à l origine de nombreuses infections nosocomiales et communautaires. L apparition de multi-résistances aux antibiotiques en milieu hospitalier et communautaire a suscité un intérêt pour l étude de la biologie des staphylocoques dans le but de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques. En particulier, les régulateurs globaux de la virulence, dont le système agr, ont été étudiés de manière intensive. L idée sous-jacente était qu interférer avec de tels systèmes permettrait d abolir la production des facteurs de virulence sans affecter la viabilité. Ainsi, en exerçant une pression sélective moins forte, il devrait être possible de ralentir l apparition des résistances aux antibiotiques [6]. Le système agr se compose de deux unités transcriptionnelles divergentes. L ARNIII code pour un système à deux composants et un peptide autoinducteur AIP, sécrété, qui s accumule en cours de croissance bactérienne. A une concentration seuil, le peptide AIP active le système à deux composants dont Le système de densité cellulaire agr et les réseaux de régulation. En phase stationnaire de croissance (haute régulation et, à cet égard, ils peuvent densité cellulaire), le peptide AIP sécrété active la protéine kinase AgrC qui elle-même active le régulateur être considérés comme étant les de réponse AgrA. Encadré bleu : AgrA régule de manière indépendante de l ARNIII l expression des peptides équivalents fonctionnels des miarn PSM et les protéines du métabolisme [7]. La régulation de la synthèse des protéines du cycle TCA pourrait se chez les eucaryotes. faire par l intermédiaire d un petit ARNnc RsaE [14]. Encadré jaune en activant la synthèse de l ARNIII, AgrA régule de manière indirecte les gènes de virulence. La structure secondaire de l ARNIII est décomposée en L ARNIII et ses réseaux de régulation codantes sont respectivement en rouge et en noir. L ARNIII interagit directement avec les ARNm cibles trois domaines : la phase ouverte de lecture codant pour l hémolysine d est en vert et les régions 5 et 3 non (nom L ARNIII de Staphylococcus aureus des protéines en violet) pour réprimer ou activer leur traduction. En réprimant la synthèse de Rot, l ARNIII active de manière indirecte la production des exotoxines. (Barre), répression; (flèche), activation. Rot et AgrA est un exemple typique de riborégulateur multifonctionnel. Il a été régulent la transcription alors que l ARNIII agit au niveau post-transcriptionnel. Encadré rose : mécanisme de répression de la synthèse de Rot par l ARNIII [10] : les deux ARN forment deux interactions boucle-boucle qui découvert en 1993 par R. Novick, bloquent l accès du ribosome et génèrent un site de coupure pour l endoribonucléase III (RNase III). 4 RSB - décembre 2010 P Réprime - Enzymes du cycle du TCA - Métabolisme des acides aminés SD AUG RNase III AIP AgrD AUG AgrB hld ' C CCA U 6 1 H14 3' agra H7 2 A CCC U 11 Rot agrc ARNIII A CCC CU H13 D ARNIII P2 P3 agrb Régulation dépendante de l'arniii Réprime coagulase protéine A Protéine fixant le fibrinogène autolysines Active hémolysine α hémolysines sérine protéases auréolysine lipase hld Adhésion Défense Synthèse du peptidoglycane Dissémination Défense

5 Actualités scientifiques REGARD SUR LA BIOCHIMIE le régulateur de réponse AgrA qui, sous sa forme phosphorylée, auto-active son propre opéron et la synthèse de l AR- NIII. AgrA et l ARNIII sont les deux effecteurs du système de densité cellulaire. AgrA régule l expression de gènes impliqués dans le métabolisme et des peptides cytolytiques PSM et, par l intermédiaire de l ARNIII, régule la synthèse de nombreux facteurs de virulence [7] (cf figure). Ceci suggère que l ARNIII aurait co-évolué avec l acquisition des facteurs de virulence. L ARNIII est à la fois un ARN messager, codant pour l hémolysine d, et un régulateur agissant au niveau post-transcriptionnel par le biais d appariements avec ses ARN messagers cibles. La structure de l ARNIII est organisée de telle sorte que ses trois activités sont portées par des domaines distincts. La région centrale porte la phase ouverte de lecture. La région 5 non codante contient l information requise pour activer la traduction de l ARN messager codant pour l hémolysine d [8]. Cette région, en s appariant à l ARN messager hla, empêche la formation d une structure inhibitrice et favorise la fixation du ribosome. En revanche, la partie 3 non codante de l ARNIII réprime la traduction, essentiellement par trois tiges-boucles caractérisées par un motif redondant riche en cytosines, complémentaire à la séquence Shine-Dalgarno des ARN messagers cibles [9-11]. La structure des deux ARN est essentielle ; elle induit une reconnaissance rapide initiée par une interaction de type boucle-boucle ensuite convertie en un complexe plus stable [10,11]. Dans tous les cas, l interaction ARNIII-ARN messager inhibe le démarrage de la traduction et, de manière concomitante, l endoribonucléase III (RNase III) initie la dégradation du duplex. Les cibles réprimées incluent plusieurs protéines d adhésion cellulaire impliquées dans les mécanismes de défense (protéine A, coagulase ), les protéines participant au métabolisme du peptidoglycane et le facteur de transcription Rot qui réprime la synthèse des exotoxines. Ainsi, en réprimant la synthèse de Rot, l ARNIII active indirectement la production des exotoxines (hémolysines, protéases). L ARNIII peut être vu comme un opéron de petits sarn coordonnant la synthèse des facteurs de virulence et contribuant au maintien de l intégrité du peptidoglycane. Il favoriserait l acquisition de nouveaux nutriments et la dissémination de S. aureus dans les tissus de l hôte. Le RNome de Staphylococcus aureus L étude du système agr illustre la complexité des réseaux de régulation qui relient le système de densité cellulaire, le métabolisme et la virulence. De nombreuses questions subsistent: hormis la RNase III, quelles sont les protéines associées au mécanisme d action de l ARNIII? Quelle est l étendue des fonctions régulées par la RNase III? Certaines souches de S. aureus n exprimant pas l ARNIII, quels sont alors les mécanismes de substitution? Existe-t-il d autres ARN qui pourraient soit agir de manière coordonnée à l ARNIII soit exercer un rôle antagoniste? Quelle est la dynamique de ces réseaux de régulation au sein d une population? Quelle est l influence de l hôte sur l expression de ces ARN? Y a-t-il une influence des autres bactéries de la flore sur l expression des ARN régulateurs de S. aureus au sein de l hôte? En plus de l ARNIII, il a été montré qu un ARN non-codant issu d îlots de pathogénicité est impliqué dans la virulence [12,13]. D autres ARN non-codant régulent le métabolisme central ou font partie intégrante du régulon SigmaB requis pour la virulence [14,15]. Le transcriptome d une souche de S. aureus a été récemment étudié, révélant l existence de plus de 200 ARN [16]. Parmi ceux-ci, on retrouve les régions régulatrices des ARN messagers agissant en cis, les ARN non codants (issus de régions intergéniques autonomes) et les ARN antisens (transcrits de manière opposée à la cible). Plusieurs de ces ARN antisens régulent les éléments mobiles (transposition). Enfin, dans une des souches de Staphylococcus epidermidis, les éléments CRISPR expriment de petits ARN qui limitent le transfert horizontal de plasmides, un mécanisme de défense qui n est pas sans rappeler le mécanisme d ARN interférence utilisé par les plantes contre certains virus [17]. Ainsi, il devient important de replacer la fonction de ces nouveaux ARN et leurs réseaux de régulation dans la physiologie globale de S. aureus. On peut s attendre à découvrir de nouveaux mécanismes de régulation et à révéler de nouvelles cibles thérapeutiques en vue de traitements anti-microbiens [18]. Nous ne sommes pas encore arrivés au bout de nos surprises Pierre Fechter, Clément Chevalier & Pascale Romby Architecture et Réactivité de l ARN, Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IBMC), Strasbourg 1 - Waters L.S. and Storz G. (2009) Cell 136, Breaker R.R. (2009) Future Microbiology 4, Vogel J. (2009) Mol. Microbiol. 71, Figueroa-Bossi N., Valentini M., Malleret L., Fiorini F. and Bossi L. (2009) Genes & Dev. 23, Novick R.P., Ross H.F., Projan S.J., Kornblum J., Kreiswirth B. and Moghazeh S. (1993) EMBO J. 12, Clatworthy A.E., Pierson E. and Hung D.T. (2007) Nat. Chem. Biol. 3, Queck S.Y., Jameson-Lee M., Villaruz A.E., Bach T.H., Khan B.A., Sturdevant D.E., Ricklefs S.M., Li M. and Otto M. (2008) Mol Cell 32, Morfeldt E., Taylor D., Von Gabain A. and Ardvison S. (1995) EMBI J. 14, Geisinger E., Adhkari R.P., Jin R., Ross H.F. and Novick R.P. (2006) Mol. Microbiol. 61, Boisset S., Geissmann T., Huntzinger E., Fechter P., Bendridi N., Possedko M., Chevalier C., Helfer A.C., Benito Y., Jacquier A., Gaspin C., Vandenesch F. and Romby P. (2007) Genes & Dev. 21, Chevalier C., Boisset S., Rommily C., Masquida B., Fechter P., Geissmann T., Vandenesch F. and Romby P. (2010) PloS Pathogen 6, e Pichon C. and Felden B. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, Chabelskaya S., Gaillot O. and Felden B. (2010) Plos Pathogen. 6, e Geissmann T., Chevalier C., Cros MJ., Boisset S., Fechter P., Noirot C., Schrenzel J., François P., Vandenesch, F., Gaspin C. and Romby P. (2009) Nucleic Acids Res. 37, Bohn C., Rigoulay C., Chabelskaya S., Sharma, CM., Marchais A., Skorski P., Borezée-Durant E., Barbet R., Jacquet E., Jacq A., Gautheret D., Felden B., Vogel J. and Bouloc P. (2010) Nucleic Acids Res. (sous presse) Beaume M., Hernandez D., Farinelli L., Deluen C., Linder P., Gaspin C., Romby P., Schrenzel J. and François P. (2010) PloS One 5, e Marraffini LA. and Sontheimer EJ. (2008) Science 322, Muhlbacher J., Brouillette E., Allard M., Fortier LC., Malouin F. and Lafontaine D.A. (2010) PloS Pathogen 6, e RSB - décembre

6 La sphingosine 1-phosphate dans la régulation de l hypoxie intratumorale Hypoxie et cancer Le point sur... Dans un tissu tumoral, la distance intercapillaire est de l ordre de 150 µm contre 20 à 30 dans un tissu sain. Or, la diffusion passive de l oxygène ne dépasse pas 50 à 70 µm. Au-delà de cette limite, les cellules situées au centre de la tumeur ne sont plus correctement oxygénées, mais restent viables et sont dites hypoxiques. Les conséquences de la présence de zones hypoxiques sont multiples : développement d une néovascularisation tumorale pour pallier à l hypoxie, phénotypes plus agressifs associés à un mauvais pronostic et résistance aux thérapies conventionnelles. Il existe en effet une corrélation entre le degré d hypoxie au sein de la tumeur et l échec thérapeutique. Ceci suggère que l augmentation transitoire de l oxygénation tumorale locale serait capable d améliorer l efficacité des différentes thérapeutiques conventionnelles [1]. Les facteurs HIF: facteurs clés de l adaptation au stress hypoxique Le stress hypoxique entraîne la stabilisation de la famille des facteurs de transcription HIF (Hypoxia Inducible Factor) - comprenant HIF-1, HIF-2, et HIF-3 - et dont HIF-1 est le représentant canonique [2]. Ces facteurs de transcription hétérodimériques sont composés des sous-unités HIFa et HIFß. La sous-unité HIFß est exprimée de manière constitutive. La stabilité de la sous-unité HIFa est, quant à elle, régulée par le taux d oxygène [3]. En condition de normoxie, la protéine est hydroxylée par des prolyl-hydroxylases. Cette forme hydroxylée est alors reconnue par le suppresseur de tumeur pvhl (protéine de Von Hippel-Lindau), entraînant son ubiquitination et sa dégradation par le protéasome. En hypoxie, les prolyl-hydroxylases sont inactives, HIFa n est plus dégradée et s accumule avant de rejoindre le noyau et de s associer avec son partenaire HIFß. Le dimère HIF ainsi formé se fixe sur les séquences consensus HRE (Hypoxia Responsive Element) contenues dans les promoteurs des gènes cibles (plus de cent gènes) dont le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), l EPO (érythropoïétine) ou encore les transporteurs de glucose GLUT. Ces gènes induits en hypoxie sont impliqués dans la prolifération, la survie, l angiogenèse, les métastases, le métabolisme du glucose et la régulation du ph [4]. Surexprimé dans de nombreux cancers, corrélé à un mauvais pronostic et à l échec thérapeutique [5], HIF-1 - le principal facteur de réponse à l hypoxie - représente donc une cible de choix pour de futures stratégies thérapeutiques [6]. Quand la sphingosine 1-phosphate rencontre la signalisation hypoxique La sphingosine 1-phosphate est un sphingolipide impliqué dans la régulation de la croissance tumorale, la survie, l invasion et l angiogenèse (Figure 1). Son faible taux dans les cellules est finement contrôlé entre synthèse et dégradation. Il a été suggéré que la balance entre les taux de sphingosine 1-phosphate et de ses précurseurs métaboliques céramide et sphingosine (médiateurs de la mort cellulaire) détermine le destin de la Actualités Scientifiques cellule [7]. Le régulateur clef de ce biostat sphingolipidique est la sphingosine kinase-1 (SphK1), l enzyme convertissant la sphingosine en sphingosine 1-phosphate. L activité SphK1 est stimulée par de nombreux agonistes (facteurs de croissance, hormones ) La sphingosine 1-phosphate peut agir extracellulairement - après export par des transporteurs ABC - en se liant à l un de ses cinq récepteurs (S1P 1-5 de type RCPG) pour induire une cascade de signalisation paracrine ou autocrine, ou intracellulairement par un mécanisme qui reste à élucider [8]. La production de sphingosine 1-phosphate, ainsi que ses effets biologiques, peuvent être bloqués par l inhibition de l activité SphK1, démontrant que SphK1 joue un rôle crucial dans les effets attribués à la sphingosine 1-phosphate. De nombreuses études établissent le rôle de SphK1 dans la promotion de la Céramide Sphingosine Sphingosine Kinase-1 (SphK1) Sphingosine 1-Phosphate apoptose survie prolifération angiogenèse carcinogenèse. Elle est en outre une cible pour de nombreux traitements. En effet, depuis la mise en évidence de son rôle oncogénique, SphK1 a été montrée être surexprimée dans de nombreuses tumeurs, et son expression a même été corrélée avec une survie écourtée chez les patients atteints de cancer du sein, de l estomac et du cerveau. D un autre côté, de nombreuses thérapies antitumorales induisent une inhibition de l activité SphK1 in vitro et chez l animal, alors que sa surexpression protège les cellules tumorales de l apoptose [9]. Plusieurs études ont suggéré un rôle du métabolisme de la sphingosine 1-phosphate dans la réponse à l hypoxie dans des cellules normales. En effet, SphK1 est impliquée dans l adaptation des cardiomyocytes à l ischémie à la fois in vitro et dans des modèles animaux [10-12]. Par ailleurs, l hypoxie augmente la prolifération de cellules musculaires lisses de façon dépendante de la sphingosine 1-phosphate [13,14]. Malgré cette littérature et l importance de l hypoxie dans le cancer, l association entre la signalisation SphK1/sphingosine 1-phosphate et l adaptation à l hypoxie n a été que très récemment explorée dans des modèles tumoraux. Menées dans cinq modèles (prostate, sein, gliome, rein, poumon), nos études suggèrent un rôle canonique pour SphK1 dans l adaptation des cellules tumorales à l hypoxie [15]. Une stimulation rapide et transitoire de l activité SphK1, précédant toujours l accumulation de HIF-1a, est observée sous hypoxie. Cette augmentation de l activité enzymatique de SphK1 (expression protéique inchangée) semble dépendante de la production d espèces réactives de l oxygène. Le mécanisme par lequel ces espèces réactives régulent l activité SphK1 est actuellement en cours d étude. De nombreux travaux suggèrent qu elles modulent de manière directe le taux de HIF-1a [16] à travers l inhibition des prolyl-hydroxylases. Cette inhibition de l hydroxylation de HIF-1a empêche son interaction avec la protéine pvhl, un composant du complexe multiprotéique E3-ubiquitine ligase du protéasome, entraînant ainsi la stabilisation de HIF-1a. Par ailleurs, des travaux montrent que les espèces réactives de 6 RSB - décembre 2010

7 l oxygène peuvent également réguler indirectement la stabilisation de HIF-1a via la voie Akt/GSK3ß [17]. De façon très intéressante, nous montrons qu en hypoxie la stabilisation de HIF-1a induite par SphK1 via l oxygène est régulée par cette voie. L inhibition (inhibiteur pharmacologique ou sirna) de SphK1 en hypoxie entraîne une diminution de la phosphorylation activatrice de la protéine Akt et une inhibition de la forme inactive de la GSK3ß. Cette modulation de la voie Akt/ GSK3ß inhibe l accumulation de HIF-1a ainsi que son activité transcriptionnelle dans toutes les lignées tumorales testées. Des études sont actuellement en cours pour déterminer comment la sphingosine 1-phosphate produite après activation de la SphK1 en hypoxie régule la voie Akt/GSK3ß. Une des voies de régulation du taux intracellulaire de HIF 1a étant représentée par la voie ubiquitine-protéasome, nous avons voulu déterminer si la diminution du taux intracellulaire de HIF-1a en hypoxie, par inhibition spécifique de SphK1, pouvait être due à l activation de la dégradation de HIF-1a par le protéasome. Ainsi, en hypoxie, l inhibition du protéasome par le MG132 réverse complètement la dégradation de HIF 1a induite par l inhibition spécifique de SphK1. Par ailleurs, à l aide de lignées déficientes ou reconstituées en pvhl, nos travaux ont permis de mettre en évidence que cette régulation de la stabilisation de HIF-1a relayée par SphK1 et le protéasome, est dépendante de pvhl [15] (Figure 2). HIF-1a est décrit comme le pivot central de l adaptation au stress hypoxique dans de nombreux types tumoraux; cependant des études récentes ont montré le rôle capital de HIF- 2a. Bien que très similaires, les sous-unités HIFa ont un profil d expression tissulaire différent. Si HIF-1a est ubiquiste, l expression de HIF-2a se limite quant à elle à l endothélium, au rein, cœur, poumon, épithélium gastrointestinal et quelques cellules du système nerveux central [18]. Bien que HIF-1a et HIF-2a se fixent sur le même séquences HRE, des études montrent que HIF-1a régule préférentiellement des gènes hypoxie ROS Sphingosine impliqués dans le métabolisme glycolytique alors que HIF-2a contrôlerait l angiogenèse. Des études récentes ont montré que HIF-2a, et non HIF-1a, serait impliqué dans la progression tumorale les carcinomes rénaux à cellules claires (RCC) et aurait un rôle critique dans ces tumeurs [19]. Différents sous-groupes de RCC ont été récemment identifiés en clinique humaine, les uns exprimant HIF-1a et HIF-2a, les autres uniquement HIF-2a [20]. SphK1 Sphingosine1P Actualités Scientifiques AKT GSK3 S1PR AKT P GSK3 P REGARD SUR LA BIOCHIMIE HIF-1 De façon intéressante, des travaux ont récemment suggéré un lien entre la voie de la SphK1/sphingosine 1-phosphate et HIF-2a dans des lignées cellulaires de glioblastomes U87 en utilisant un mimétique de l hypoxie (CoCl2). Dans ces conditions d hypoxie chimique, les auteurs montrent une augmentation de l ARNm, du taux protéique ainsi que de l activité enzymatique de SphK1. L utilisation d un sirna dirigée contre HIF-2a inhibe l augmentation de SphK1 alors que l extinction de HIF-1a par ARN interférence conduit à une augmentation du taux de HIF-2a et de SphK1. Enfin, les auteurs décrivent lors de ce travail une interaction directe entre le promoteur de SphK1 et HIF-2a [21]. Bien qu apparemment contradictoires avec nos travaux dans lesquels nous montrons dans la même lignée tumorale humaine - que l augmentation d activité de SphK1 induite par l hypoxie serait un signal en amont de la stabilisation d HIF-1a, il est important de noter que, dans l étude d Anelli et al, l influence de l activité de la SphK1 sur le taux de HIF-1a n a pas été étudiée. De plus, l hypoxie chimique utilisée dans ces travaux (CoCl 2 ) ne met pas en jeu les mêmes voies de signalisation que dans le cas d une hypoxie vraie (0.1% O 2 ) utilisée dans notre étude. Néanmoins, il est envisageable que l activité de SphK1 régule en premier lieu l activité de HIF-1a (et/ou HIF-2a) qui régulerait à son tour la transcription de SphK1 et ainsi la survie et l angiogenèse contrôlées par la sphingosine 1-phosphate. Des études supplémentaires sont indispensables pour déterminer si (i) SphK1 est un gène cible de HIF-2a comme cela a été suggéré [21], et si (ii) l activité de SphK1 peut contrôler HIF-2a comme dans le cas de HIF-1a [15], dans des modèles pertinents représentés par les carcinomes rénaux à cellules claires. nouvelles cibles thérapeutiques Les thérapies anticancéreuses émergentes peuvent cibler à la fois les cellules tumorales et leur microenvironnement. Ainsi l arsenal thérapeutique s est élargi et l espérance de vie des patients s est significativement améliorée mais celle-ci reste encore limitée. Ces thérapeutiques ciblées visent essentiellement à limiter la néoangiogenèse en bloquant le VEGF induit par HIF- 1. Ces stratégies ont prouvé leur efficacité et ont mis en évidence l intérêt de cibler l activité de HIF-1 pour de futures applications thérapeutiques. Au vu de son importance, il semble évident que l inhibition de son activité représente un enjeu pertinent pour moduler l hypoxie tumorale et ses conséquences en terme d accroissement du potentiel invasif, de développement de la néoangiogenèse, de développement métastatique et d incidence sur la mortalité des patients. HIF-1 étant un facteur de transcription, la découverte de molécules inhibitrices spécifiques de ce facteur est délicate si ce n est quasi impossible [6]. De nos travaux, il ressort que SphK1 est un modulateur clé du principal facteur d adaptation à l hypoxie, HIF-1a. Ainsi, nous proposons que l inhibition de cette voie serait apte à bloquer les mécanismes d adaptation à l hypoxie et ses conséquences moléculaires dans différentes tumeurs solides humaines. Dans une tumeur, les vaisseaux tumoraux sont tortueux, irréguliers, présentent des fuites et RSB - décembre pvhl HIF-1 polyubiquitylation reconnaissance par pvhl HIF-1 dégradation par le protéasome HIF-1 HIF-1 gènes cibles (VEGF, GLUT-1...) transcription

8 Actualités Scientifiques des terminaisons aveugles [22]. Cette caractéristique conduit à l inefficacité de la circulation tumorale se traduisant par des zones d hypoxie et l activation de HIF-1. En complément des molécules développées spécifiquement pour leurs propriétés antiangiogéniques telles que les stratégies anti-vegf [23], de nouvelles stratégies ciblant les voies de régulation contrôlant l activité de HIF-1 peuvent présenter des effets anti-néovascularisation comme il a été récemment illustré par une approche anti-pi3 Kinase [24]. De façon similaire aux études ciblant PI3K ou VEGF, nous proposons que la stratégie d inhibition de la voie SphK1/sphingosine 1-phosphate, qui est augmentée en hypoxie, entraînera une oxygénation du microenvironnement tumoral et améliorera la réponse aux traitements conventionnels selon le concept de normalisation vasculaire introduit par Jain et coll. [22]. Des protéines pour visualiser des détails de quelques nanomètres La protéine fluorescente verte (GFP) est mondialement connue depuis son utilisation massive dans les laboratoires, dès les années 90, à des buts d imagerie cellulaire ou de tests in vitro. Sa découverte et son amélioration ont même donné lieu à la remise du prix Nobel de chimie Pourtant, toute une nouvelle famille de protéines fluorescentes moins connues mais aux propriétés extrêmement utiles aux biochimistes et aux biologistes cellulaires a été découverte dans des coraux et des anémones au début des années Ces protéines fluorescentes ont la particularité d être photoactivables soit par une conversion irréversible d une couleur à une autre, soit par une commutation réversible entre des Il est important de souligner que SphK1 et la production de sphingosine 1-phosphate exercent des effets spécifiques sur les cellules endothéliales via les récepteurs aux sphingosine 1-phosphate qui sont très abondants sur les cellules endothéliales afin de promouvoir la formation de vaisseaux au cours du développement tumoral [8]. Pour cette raison, l extinction de la voie SphK1/sphingosine 1-phosphate présente l intérêt d impacter à la fois le compartiment tumoral mais aussi la composante endothéliale. Cette stratégie originale nous permet donc d envisager: (i) un effet indirect sur l angiogenèse dû à une diminution de l activité de HIF-1 dans les cellules tumorales hypoxiques conduisant à une inhibition de facteurs proangiogéniques type VEGF et (ii) un effet antiangiogénique direct sur les cellules endothéliales équivalent à celui observé avec les thérapies anti-vegf actuelles. Isabelle Ader, Olivier Cuvillier CNRS, Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, Université Paul Sabatier Toulouse 1 - Overgaard J. (2007) J Clin Oncol 25, Rankin E.B. and Giaccia A.J. (2008) Cell Death Differ 15, Semenza G.L. (2003) Nat Rev Cancer 3, Harris A.L. (2002) Nat Rev Cancer 2, Vaupel P. and Mayer A. (2007) Cancer Metastasis Rev 26, Melillo G. (2007) Cancer Metastasis Rev 26, Cuvillier O. et al. (1996) Nature 381, Spiegel S. and Milstien S. (2003) Nat Rev Mol Cell Biol 4, Cuvillier O. et al. (2010) Curr Mol Pharmacol 3, Jin Z.Q., Goetzl E.J. and Karliner J.S. (2004) Circulation 110, Pchejetski D. et al. (2007) Circ Res 100, Tao R. et al. (2007) Cardiovasc Res 74, Yun J.K. and Kester M. (2002) Arch Biochem Biophys 408, Ahmad M. et al. (2006) Prostaglandins Other Lipid Mediat 79, Ader I. et al. (2008) Cancer Res 68, Kaelin W.G. Jr. and Ratcliffe P.J. (2008) Mol Cell 30, Skuli N. et al. (2006) Cancer Res 66, Wiesener M.S. et al. (2003) FASEB J 17, Qing G. and Simon M.C. (2009) Curr Opin Genet Dev 19, Kaelin W.G. Jr. (2008) Cancer Cell 14, Anelli V. (2008) J Biol Chem 283, Jain R.K. (2005) Science 307, Winkler F. (2004) Cancer Cell 6, Pore N. (2006) Cancer Res 66, La rencontre de la biologie moléculaire et de la microscopie. La création de nouvelles protéines fluorescentes permet l acquisition d images multicolores de super-résolution. états fluorescents et non-fluorescents. Ces transformations induites par la lumière peuvent à première vue sembler être autant d événements parasites à l utilisation des protéines fluorescentes, mais elles constituent l élément sine qua non à l application des techniques de microscopie de super-localisation par photoactivation stochastique PALM/STORM [1,2]. Ces techniques permettent de contourner le critère d Abbe- Rayleigh, vieux de plus de 130 ans et qui stipule que la résolution spatiale obtenue par microscopie photonique à champ lointain ne peut être meilleure qu environ 200 nm car elle est limitée par la diffraction de la lumière [3]. Les résolutions théoriques atteintes par ces techniques de microscopie en champ large sont de l ordre de quelques nanomètres, soit environ 10 fois meilleures que les meilleurs microscopes «classiques». L utilisation de protéines fluorescentes permet une très grande spécificité des protéines cibles puisqu elles y sont génétiquement fusionnées. Par contre, elles présentent le défaut d être très sensibles au photoblanchiment et d émettre assez peu de photons, pourtant nécessaires à une localisation moléculaire précise. Afin d espérer améliorer les résultats obtenus en microscopie à super-localisation, il convient d obtenir des protéines plus résistantes, plus brillantes et aux mécanismes adéquats pour le PALM. Encore faut-il comprendre en détail leur photophysique! A Grenoble (ESRF et IBS), et en collaboration avec l Université d Ulm (Allemagne), nous avons étudié les protéines 8 RSB - décembre 2010

9 fluorescentes photoactivables par des techniques de spectroscopie UV/Vis et Raman, de cristallographie aux rayons X, de modélisation... Les résultats ont dépassé nos espérances puisque nous avons proposé des explications structurales à la photocommutation réversible [4, 5], des explications sur le mécanisme réactionnel des protéines convertibles d une couleur à une autre [6,11], élucidé une voie de photoblanchiment irréversible [7] et même montré que l on pouvait utiliser ces protéines pour des applications de stockage réversible ou irréversible de données [8]. De toutes ces données est née IrisFP, première protéine fluorescente photoactivable capable de combiner à la fois les propriétés de photoconversion irréversible du vert au rouge mais également d être photocommutable réversiblement entre des états fluorescents et non-fluorescents dans chacune des deux couleurs [8]. Ce comportement photophysique est à ce jour le plus complexe rapporté pour une protéine fluorescente photoactivable [9]. Il permet le suivi temporel in-vivo à résolution sub-diffractionnelle d un groupe de molécules photoconverties en rouge par rapport à un ensemble de molécules à l état initial [10]. Nous avons récemment transposé avec succès les connaissances acquises avec IrisFP sur d autres protéines fluorescentes et montré qu elles devenaient très efficaces comme sondes PALM à deux couleurs. Nous avons identifié par la même occasion les quelques acides aminés qu il suffit de muter pour moduler à loisir les efficacités de photoconversion et photocommutation de ces nouveaux variants (article en préparation). Nul doute qu avec ces progrès et ceux réalisés par les détecteurs de plus en plus sensibles, des images microscopiques avec des résolutions spatiales et temporelles sans cesse améliorées vont apparaître. Ces techniques permettent déjà de distinguer une multitude de détails structuraux jusqu alors inaccessibles par microscopie de fluorescence, car situés dans des gammes de distances inférieures à celles imposées par les lois de diffraction de la lumière. Si historiquement les premières applications ont été assez timides et limitées au cytosquelette, elles deviennent de plus en plus ambitieuses. De plus en plus de couleurs simultanées sont utilisées, de plus en plus de compartiments cellulaires, de nanostructures et d interactions entre différentes protéines sont actuellement visés... Il s agit de tout un nouveau monde qu il nous reste à explorer. Virgile Adam (Prix de la Fondation Dina Surdin 2009). Laboratory for Photochemistry and Spectroscopy, Katholieke Universiteit Leuven, Belgium 1 - Betzig E. et al. (2006). Science 313, Rust M. J. et al. (2006). Nat Methods 3, Abbe E. K. (1873). Archiv für Mikroskopische Anatomie 9, Adam V. et al. (2008). Proc Natl Acad Sci USA 105, Faro A. R. et al. (2010). Photochem Photobiol Sci 9, Adam V. et al. (2009). Biochemistry 48, Adam V. et al. (2009). J Am Chem Soc 131, Adam V. et al. (2010). J Biotechnol 149, Chudakov D. M. et al. (2010). Physiol Rev 90, Fuchs, J. et al. (2010). Nat Methods 7, Lelimousin M. et al. (2009). J Am Chem Soc 131, Actualités Scientifiques REGARD SUR LA BIOCHIMIE ARNtm-SmpB, voyage au centre du ribosome bactérien. Chez tous les organismes la traduction est assurée par le ribosome. Ce dernier décode les ARN messagers en une séquence précise d acides aminés en utilisant les ARN de transfert comme intermédiaires [1]. Lorsque la traduction se déroule sur des ARNm tronqués auxquels manque un codon de terminaison, le ribosome se bloque à leur extrémité 3 tandis que la protéine en cours de synthèse reste liée au peptidyl-arnt. Les bactéries possèdent un système de contrôlequalité, appelé trans-traduction, qui cible spécifiquement ces ribosomes bloqués. Ce système fait intervenir deux facteurs spécifiques : l ARN transfert-messager (ARNtm) et la petite protéine SmpB [2,3]. Il permet de libérer les ribosomes bloqués et de catalyser la destruction de l ARNm tronqué ainsi que de la protéine incomplète. L ARNtm est une molécule d ARN hybride de 230 à 400 nucléotides selon les espèces et fonctionnant à la fois comme un ARNt et un ARNm. Son architecture générale comprend un domaine pseudo-arnt (trna-like domain, TLD), une boucle de pseudonœuds (PKs), une longue hélice H2 qui connecte le TLD aux pseudonœuds, et un petit cadre ouvert de lecture se terminant par un codon de terminaison (mrna-like domain, MLD) (Figure 1) [4]. Le TLD possède un bras accepteur, toujours aminoacylé par une alanine, et un bras T, mais pas de bras D ni de boucle anticodon. SmpB est une petite protéine basique d environ 18 kda qui possède une forte affinité pour l ARNtm et pour le ribosome [5]. Si l ARNtm est connu Structure secondaire de l ARNtm de Thermus thermophilus depuis 1978 [6], c est en 1995 qu est enfin mise en évidence la trans-traduction [7,8]. En moins de quinze ans, un grand nombre d études biochimiques, génétiques et structurales ont confirmé et permis de comprendre le mécanisme général de son fonctionnement (Figure 2). Si ce mécanisme est généralement bien admis, l enchaînement des événements et le rôle précis des différents facteurs font encore débat. Des études structurales par cryo-microscopie électronique à transmission de complexes ribosomiques en cours de trans-traduction ont permis de mieux appréhender les étapes précoces du processus [9-13]. L ARNtm est amené au site A vide du ribosome par le facteur d élongation EF- Tu GTP, de la même manière qu un ARNt canonique, mais en présence de SmpB. L absence d interactions codon-anticodon est compensée par une molécule de SmpB tandis que le positionnement des pseudonœuds au niveau de la petite sous-unité du ribosome place le MLD à prox- RSB - décembre A Mécanisme de la trans-traduction

10 imité du canal ARNm. Une seconde molécule de SmpB est retrouvée au contact de la grande sous-unité. Après hydrolyse du GTP, EF-Tu GDP et la molécule de SmpB contactant la grande sous-unité sont libérés, tandis que le complexe TLD- SmpB est accommodé dans le site A. SmpB compensant toujours l absence d interactions codon-anticodon. La suite du processus restait jusqu à très récemment encore mystérieuse. En effet, le complexe ARNtm-SmpB est environ six fois plus grand qu un ARNt canonique, ce qui complique grandement sa traversée du ribosome. D autre part, le positionnement du codon de redémarrage de la traduction dans le site de décodage nécessite un mécanisme très particulier pour compenser l absence de facteurs d initiation. Deux études récentes de cryo-microscopie électronique permettent enfin d apporter des réponses à ces deux questions cruciales [14,15]. Ces deux études ont été menées à partir de complexes ARNtm-SmpB/ribosomes formés in vivo pour l une [15] et in vitro pour l autre [14]. Les résultats convergent et permettent de visualiser les changements de conformation nécessaires au transit du complexe ARNtm-SmpB du site A au site P d un ribosome bloqué. Le complexe TLD-SmpB se comporte de la même façon qu un ARNt canonique, l absence de branche anticodon étant compensée par SmpB. L ARNtm maintient une structure très stable lors de ce passage. Les deux modèles atomiques du couple ARNtm-SmpB transloqué permettent d élucider le redémarrage de la traduction sur la partie codante de l ARNtm. De nouvelles interactions entre SmpB et la région simple brin en amont de la région codante de l ARNtm permettent en effet de positionner le codon de redémarrage de la traduction dans le site de décodage tout en laissant la possibilité à un ARNt de pénétrer dans le site A (Figure 3A). Ces résultats sont en accord avec de précédentes études génétiques et biochimiques qui ont mis en évidence, d une part, les quatre acides aminés de la partie globulaire de SmpB impliqués dans cette liaison [16], et d autre part, les cinq nucléotides en amont de la séquence codante de l ARNtm essentiels dans la sélection du bon cadre de lecture [17]. D autre part, l étude de Weis et collaborateurs permet de visualiser un complexe ribosome-arntm-smpb en cours de translocation, présentant une rotation caractéristique des deux sous-unités du ribosome l une par rapport à l autre. Ce mouvement, appelé mouvement de cliquet ou de ratchet, est caractérisé par un changement important dans la topologie des ponts entre les deux sous-unités et intervient chronologiquement juste avant la translocation EF-G dépendante [18]. Ce mouvement permet à l ARNtm de traverser un pont entre les deux sous-unités et de se positionner dans le site P sans avoir à se déstructurer. En effet dans l état accommodé, le pont B1a, formé par l interaction de l hélice H38 de l ARN ribosomique 23S avec la protéine S13 de la petite sous-unité, empêche physiquement l ARNtm de progresser au sein du ribosome. Une déstabilisation de ce pont lors du mouvement de ratchet permet d ouvrir le portillon moléculaire, permettant à l hélice Actualités Scientifiques 50S 30S A B E ARNt TLD-SmpB P A H2 E PK4 PK1 PK4 H2 de l ARNtm de passer de l autre côté et d accompagner le mouvement du couple TLD-SmpB dans le site P (Figure 3B). Ces travaux apportent des réponses définitives à plusieurs questions en suspens sur le mécanisme de la trans-traduction. Le complexe TLD-SmpB mime un ARNt canonique durant les étapes d accommodation et de translocation, SmpB compensant l absence d interactions codon-anticodon. Durant la translocation au site P, la boucle de pseudonœuds reste structurée et sa progression au sein du ribosome commence par le passage de l hélice H2 de l autre côté du pont B1a, traversée rendue possible par la déstabilisation de ce dernier lors du mouvement de ratchet du ribosome. Lors de cette étape, l interaction de SmpB, en sandwich entre le TLD d une part, et la région en amont de la séquence codante de l ARNtm d autre part, permet de positionner le codon de redémarrage dans le site de décodage sans l assistance de facteurs d initiation, ni d ARNt initiateur. Dans la logique des résultats présentés ici, la transition du complexe ARNtm-SmpB du site P au site E promet de révéler de nombreux autres changements, tant dans le ribosome que dans la topologie de l ARNtm lui-même. Le processus hors normes de trans-traduction, porté par le complexe ARNtm-SmpB, n a pas fini de nous surprendre. Félix Weis et Reynald Gillet (Université de Rennes, UMR6026 du CNRS, U835 de l INSERM) Ouverture du pont B1a 1 - Schmeing T. M. and Ramakrishnan V. (2009) Nature 461, Keiler, K. C. (2008) Annu Rev Microbiol. 62, Moore S. D. and Sauer R. T. (2007) Annu Rev Biochem. 76, Felden B., Himeno H., Muto A., McCutcheon J. P., Atkins J. F. and Gesteland R. F. (1997) RNA 3, Hallier M., Desreac J. and Felden B. (2006) Nucleic Acids Res. 34, Lee S. Y., Bailey S. C. and Apirion D. (1978) J Bacteriol. 133, Keiler K. C. and Sauer R. T. (1996) J Biol Chem. 271, Tu G. F., Reid G. E., Zhang J. G., Moritz R. L. and Simpson R. J. (1995) J Biol Chem. 270, Weis F., Bron P., Rolland J. P., Thomas D., Felden B. and Gillet R. (2010) RNA 16, Cheng K., Ivanova N., Scheres S. H., Pavlov M. Y., Carazo J. M., Hebert H., Ehrenberg M. and Lindahl M. (2010) J Struct Biol. 169, Gillet R., Kaur S., Li W., Hallier M., Felden B. and Frank J. (2007) J Biol Chem. 282, Kaur S., Gillet R., Li W., Gursky R. and Frank J. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103, Valle M., Gillet R., Kaur S., Henne A., Ramakrishnan V. and Frank J. (2003) Science 300, Weis F., Bron P., Giudice E., Rolland J. P., Thomas D., Felden B. and Gillet R. (2010) EMBO J. 29, Fu J., Hashem Y., Wower I., Lei J., Liao H. Y., Zwieb C., Wower J. and Frank J. (2010) EMBO J. 29, Watts T., Cazier D., Healey D. and Buskirk A. (2009) J Mol Biol. 391, Konno T., Kurita D., Takada K., Muto A. and Himeno H. (2007) RNA 13, Korostelev A., Ermolenko D. N. and Noller H. F. (2008) Curr Opin Chem Biol. 12, RSB - décembre 2010 Hélice H2 PK1 Transit du couple ARNtm-Smpb dans le ribosome P A

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