Evaluation des propriétés anti-adhésives et biocides de films nanocomposites avec inclusions d'argent, déposés sur acier inoxydable par procédé plasma

Transcription

1 Fédération de recherche FERMaT Journée scientifique EnMAT 08 Juillet 2010 Evaluation des propriétés anti-adhésives et biocides de films nanocomposites avec inclusions d'argent, déposés sur acier inoxydable par procédé plasma N. Lebleu 1,2, C. Saulou 1,2, C. Wang 3, S. Zanna 3, R. Briandet 4, B. Despax 2, P. Raynaud 2, M. Mercier-Bonin 1 1 Laboratoire d Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés 2 Laboratoire Plasma et Conversion d Energie 3 Laboratoire de Physico-Chimie des Surfaces 4 Laboratoire Microbiologie de l Alimentation au Service de la Santé Humaine Projet ANR «BioPleasure» ( ) Laplace / LISBP / LPCS / Arcelor Mittal

2 Contexte Biofilms : source de multiples impacts négatifs 1. Formation et développement 1. Adhésion réversible 2. Adhésion irréversible 3. Colonisation 4. Maturation 5. Dispersion Biofilm de Staphylococcus aureus sur un cathéter Acier inoxydable AISI 316 L Agroalimentaire / Biomédical Prévention de la colonisation microbienne

3 Stratégie adoptée Elaboration d un revêtement de l acier inoxydable Modifier les propriétés de surface Procédé Plasma (PECVD) - Traitement de l acier inoxydable (difficile à modifier par voie chimique) - Impact environnemental réduit : besoins minimes en précurseurs et faibles rejets - Contrôle des propriétés du dépôt (suivi en ligne des paramètres opératoires) Film nanocomposite : Matrice polymérique + Nanoparticules d argent - Ions Ag+ : large spectre antimicrobien - Faible risque de résistance microbienne (contrairement aux antibiotiques) - Mode d action multi-factoriel et multi-cibles - Nanoparticules : ratio surface/volume élevé Originalité de l étude : revêtement nanocomposite combinant des propriétés anti-adhésives et antimicrobiennes

4 Plan de l exposé 1. Films nanocomposites 1.1. Elaboration par PECVD 1.2. Caractérisation 2. Evaluation des propriétés antimicrobiennes 2.1. Cellules adhérées 2.2. Biofilm mature 3. Conclusions et perspectives

5 Plan de l exposé 1. Films nanocomposites 1.1. Elaboration par PECVD 1.2. Caractérisation 2. Evaluation des propriétés antimicrobiennes 2.1. Cellules adhérées 2.2. Biofilm mature 3. Conclusions et perspectives

6 Elaboration des films nanocomposites Qu est-ce qu un plasma? Gaz ionisé globalement neutre (n électron + n anion = n cation ) Produit par une décharge électrique entre deux électrodes Mélange d ions positifs et négatifs, d électrons, d atomes, de molécules à l état fondamental ou à l état excité, de radicaux Environnement chimique très réactif Composition du plasma Spectroscopie d émission optique Plasma d argon Réaction en surface de l échantillon et formation d un dépôt solide

7 Générateur radio-fréquence (13,56 MHz) ~ Electrode d argent Acier inoxydable Réacteur sous vide primaire (50 mtorr)

8 Ar HMDSO Générateur radio-fréquence (13,56 MHz) ~ Electrode d argent Acier inoxydable Réacteur sous vide primaire (50 mtorr)

9 Ar HMDSO Générateur radio-fréquence (13,56 MHz) ~ Electrode d argent Plasma Champ électrique Acier inoxydable Réacteur sous vide primaire (50 mtorr)

10 Ar HMDSO Générateur radio-fréquence (13,56 MHz) ~ Electrode d argent Pulvérisation d argent Ag Ag Ar + Ag Plasma Acier inoxydable Réacteur sous vide primaire (50 mtorr)

11 Ar HMDSO Générateur radio-fréquence (13,56 MHz) ~ Electrode d argent Décomposition du précurseur HMDSO SiC x O y H z Plasma Polymérisation Acier inoxydable Réacteur sous vide primaire (50 mtorr)

12 Ar HMDSO Générateur radio-fréquence (13,56 MHz) ~ Electrode d argent Plasma Dépôt du film nanocomposite sur l acier inoxydable (Ag-SiC x O y H z ) Acier inoxydable Réacteur sous vide primaire (50 mtorr)

13 Plan de l exposé 1. Films nanocomposites 1.1. Elaboration par PECVD 1.2. Caractérisation TEMSCAN 2. Evaluation des propriétés antimicrobiennes 2.1. Cellules adhérées 2.2. Biofilm mature 3. Conclusions et perspectives

14 Caractérisation des films nanocomposites Microscopie Electronique à Transmission Matrice organosiliciée 20 nm Nanoparticule d argent - répartition spatiale homogène - sphériques : ø moyen = 8 ± 2 nm - structure cristalline (facettes) Epaisseur du dépôt ~ 140 nm Teneur en argent déterminée par XPS : ~ 20 % at. Ag (sous forme métallique) Nanoparticules d argent : réactivité chimique élevée

15 Plan de l exposé 1. Films nanocomposites 1.1. Elaboration par PECVD 1.2. Caractérisation 2. Evaluation des propriétés antimicrobiennes 2.1. Cellules adhérées 2.2. Biofilm mature 3. Conclusions et perspectives

16 Modèles biologiques Staphylococcus aureus MW2 Bactérie à Gram positif, coque Souche isolée de prélèvements cliniques : 0,8 µm Escherichia coli K12 MG1655 Bactérie à Gram négatif, bacille Souche modèle de laboratoire 2 µm x 0.5 µm Saccharomyces cerevisiae BY4741 Levure, ovoïde Souche utilisée en industrie agroalimentaire : 5 µm Propriétés antimicrobiennes évaluées vis-à-vis des 3 microorganismes modèles

17 Cellules adhérées Méthode ex situ Adhésion en statique dans l eau physiologique (NaCl 9 g/l) Reprise de croissance sur milieu nutritif 1,65 2,4 log 0,98 0,8 log 0, 82 1,9 log 0,17 0,01 0,01 Activité antimicrobienne démontrée sur cellules adhérées

18 Plan de l exposé 1. Films nanocomposites 1.1. Elaboration par PECVD 1.2. Caractérisation 2. Evaluation des propriétés antimicrobiennes 2.1. Cellules adhérées 2.2. Biofilm mature 3. Conclusions et perspectives

19 Biofilm mature Escherichia coli K12 MG1655 Méthode in situ Adhésion en statique dans le milieu de culture liquide (LB) Renouvellement du milieu de culture toutes les 24 h Coloration / Observations Témoin : acier inoxydable NB : échantillon différent pour chaque observation VERT (syto9) : biomasse totale ROUGE (IP) : cellules mortes (membrane endommagée) 4 h 24 h 48 h 72 h Epaisseur du biofilm Développement d un biofilm multicouches présentant peu de cellules mortes

20 Acier inoxydable Biofilm mature 4 h 24 h 48 h 72 h Film nanocomposite 4 h 24 h 48 h 72 h

21 Plan de l exposé 1. Films nanocomposites 1.1. Elaboration par PECVD 1.2. Caractérisation 2. Evaluation des propriétés antimicrobiennes 2.1. Cellules adhérées 2.2. Biofilm mature 3. Conclusions et perspectives

22 Conclusions et perspectives Prévention de la formation de biofilms Elaboration, par procédé plasma, d un revêtement nanocomposite sur l acier inoxydable Démonstration de ses propriétés antimicrobiennes vis-àvis de plusieurs microorganismes modèles, sur cellules adhérées et sur biofilm mature Optimisation des propriétés des films nanocomposites : hydrophilie / vieillissement Compréhension du mode d action des nanoparticules d argent sur les microorganismes modèles

23 Fédération de recherche FERMaT Journée scientifique EnMAT 08 Juillet 2010 Evaluation des propriétés anti-adhésives et biocides de films nanocomposites avec inclusions d'argent, déposés sur acier inoxydable par procédé plasma N. Lebleu 1,2, C. Saulou 1,2, C. Wang 3, S. Zanna 3, R. Briandet 4, B. Despax 2, P. Raynaud 2, M. Mercier-Bonin 1 1 Laboratoire d Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés 2 Laboratoire Plasma et Conversion d Energie 3 Laboratoire de Physico-Chimie des Surfaces 4 Laboratoire Microbiologie de l Alimentation au Service de la Santé Humaine Projet ANR «BioPleasure» ( ) Laplace / LISBP / LPCS / Arcelor Mittal

24 Spectroscopie d émission optique Détermination de la composition du plasma Intensité (unité arb.) 520,91 (Ag) 546,55 (Ag) 486,13 (H β ) 549,55 (Ar) Longueur d onde (nm)

25 Analyses XPS Composition élémentaire du film nanocomposite (< 10 nm) Ag 3d Majoritairement sous forme métallique Intensité (CPS) Energie de liaison (ev) 3/2 5/2 Ag3d Ag3d Ag Intensité (CPS) Ag3s Ag3p 1/2 Ag3p 1/2 3/2 O1s O C1s Si2s Si2p, Ag4s Ag4s C Si Ag4p Energie de liaison (ev)

26 Spectroscopie infrarouge (FTIR) Détermination de la structure moléculaire de la matrice C-H 2 + C-H , 2900 and 2955 cm -1 Si-O-Si cm -1 CH cm -1 Si-C 830 cm -1 Dépôt nanocomposite Absorbance ( u.a.) C=C 1560 cm -1 Matrice polymérique Nombre d onde (cm -1 ) Présence de nanoparticules d argent : incorporation de CH 3 dans le dépôt

27 Evaluation des propriétés anti-adhésives Méthode hydrodynamique in vitro : chambre à écoulement cisaillé Principe : Observer le détachement des levures, préalablement adhérées à la surface, dans des conditions hydrodynamiques contrôlées (régime laminaire) Microscope optique Chambre à écoulement cisaillé Solution saline (NaCl 0,15 M) Coupon testé Zone d observation 50 µm S. cerevisiae (NaCl 0,15 M) Débit Contrainte de cisaillement pariétale τ p (0-80 Pa)

28 Profils de détachement Cas de Saccharomyces cerevisiae % de levures adhérentes t p 50% 4 Pa t p 50% 28 Pa t p 50% non atteint Contenu en Ag 10 t p 50% 0,6 Pa Contrainte de cisaillement (Pa) Acier inoxydable non traité Matrice polymérique Films nanocomposites déposés sur acier inoxydable A faible proportion d argent : propriétés anti-adhésives de la matrice Avec proportion d argent plus élevée : diminution de l effet anti-adhésif

29 Modèles biologiques Bactérie à Gram positif Bactérie à Gram négatif S. aureus (hydrophobe) E. coli (hydrophile) S. cerevisiae (hydophile) Levures