des Actions Académiques Mutualisées Travail en autonomie en équipe de 2 ou 4 (maximum) par îlots

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1 LES METHODES DE FRACTIONNEMENTS Travaux des Actions Académiques Mutualisées Niveau Terminales STL Thème du programme Préparation et analyse des produits biologiques Situations pédagogique s Travail en autonomie en équipe de 2 ou 4 (maximum par îlots Liens internet voir dans le document Compétences B2i Matériels TICE AL Lorsque je mets en œuvre un travail de recherche, je définis mon besoin, les outils à utiliser et j'ai une idée sur la démarche que je vais mettre en œuvre. AL Lorsque j'utilise un moteur de recherche, je mets en œuvre les filtres nécessaires pour que la requête soit pertinente. AL Je sais créer et modifier un document numérique composite transportable et publiable. AL Je choisis les types de représentation adaptés à l information et au message que je souhaite communiquer (image, tableau, schéma, son, vidéo. Ordinateurs Logiciel de présentation (Powerpoint, Connexion internett Vidéoprojecteur Mots clés méthode préparative, analytique, centrifugation, électrophorèse, chromatographie, adsorption, partage, exclusion diffusion, gel filtration, tamisage moléculaire, échange d ions, affinité, solubilité différentielle, dialyse, distillation, relargage Approfondir Page 1

2 Afin d obtenir un lait à teneur réduite en lactose par action de la lactase il est indispensable d obtenir cettee enzyme. Une culture de bactérie productrice à été réalisée précédemment, il s agit maintenant d extraire et de purifier l enzyme. (cf- scénario pédagogique sur la lactase de juillet 2012 rédigé par le groupe expert : ase_ pdf L objectif de cette séance est de comprendre le principe et le cadre d utilisation des différentes techniques communément utilisées en biotechnologies afin de choisir celle(s qui nous permettra(ont de réaliser l extraction et la purification de notre enzyme. Activité n 1 : Analyse documentaire Objectifs Analyser et comprendre le principe et le cadre d utilisation de chaque technique proposée à l étude. Conduire une recherche documentaire. Durée conseillée minutes Consignes Pour chaque technique proposée (1, en vous basant sur une recherche (internet ou livresque: (2 compléter les tableaux fournis; réaliser un mini-exposé, expliquant le principe de la technique, que vous soumettrez à vos camarades. (1 2 techniques par binôme ou par îlots (de 4 élèves maximum (2 Au total 10 dossiers sont constitués (un par technique à étudier de fichiers textes, d animations et de vidéos à fournir aux élèves en cas de problèmes de connexion : exemples de documents : o Centrifugation : vidéo : ml#principe o o Electrophorèsee : Wikipédia Solubilité différentielle : Page 2

3 ndout_final_copy.pdf o Dialyse : vidéo : /vlu/proteinanalytik/ proteinfaellung.vlu/page/vsc/de/ch/8/bc/proteinanalytik/methoden_protein/fall ung_dialyse.vscml.html %201/MEB/Dialyse/ Principes%20et%20int%C3%A9r%C3%AAts%20des%20m%C3%A9thodes%2 0de%20dialyse.pdf o Distillation : video : o Chromatographie : Par adsorption De partage Exclusion-diffusion Echange d ions Affinité Page 3

4 DOCUMENTS ELEVES A COMPLETER CARACTERISTIQUESS DES PRINCIPALES TECHNIQUES DE FRACTIONNEMENT TECHNIQUES PRINCIPE Dans une solution, des particules sédimentent lorsque leur densité est supérieure à celle du solvant, dans le cas contraire, elles flottent (restent en suspension. Plus la différence de densité est importante, plus les molécules se déplacent rapidement. On peut remplacer la pesanteur par la force centrifuge, beaucoup plus importante, en utilisant une centrifugeuse. Ainsi la centrifugeuse permet de séparer des particules distinctes présentant de faibles différences de densité. CENTRIFUGATION Au cours de l électrophorèse, les molécules chargées se déplacent dans un champ électrique. La vitesse de migration dépend de la charge électrique (à cause du champ électrique, la taille et la forme géométrique (à cause du gel qui joue le rôle de tamis moléculaire. Les molécules non chargées ou de taille supérieure à celle des mailles du gel restent immobiles. Les molécules de taille intermédiaire migrent plus ou moins rapidement et plus ou moins loin en fonction de la charge. ELECTROPHORESE SOLUBILITE DIFFERENTIELLE La solubilité d une molécule chargée (protéine, acide nucléique dépend fortement de la concentration du milieu en sels (force ionique. La solubilité augmente avec la force ionique du milieu, au fur et à mesure que des ions inorganiques hydratés seront associés à la surface de la molécule de la molécule empêchant ainsi l agrégation des molécules. Lorsque la force ionique est très élevée, le sel dérobe la couronne d hydratation des molécules et conduit ainsi à leur agrégation et à leur précipitation. On peut ainsi séparer les protéines d un mélange (fractionner en fonction de leur solubilité en ajoutant des sels comme le sulfate d ammonium. Page 4

5 Les grosses molécules ne peuvent pas, à cause de leur taille, passer à travers les pores d une membrane semi-perméable, tandis que les petites molécules vont, avec le temps, se répartir également entre l intérieur et l extérieur. Après plusieurs changements de la solution externe, la concentration en sels à l intérieur du boudin de dialyse (concentration en sel, ph, sera plus faible que celle de départ. DIALYSE Le procédé utilise la différence de volatilité (capacité à s'évaporer selon la température entre les constituants afin de les séparer : sous l effet de la chaleur le composé le plus volatil s'évaporera plus facilement et composera la majeure partie des vapeurs. Par condensation de ces vapeurs, un liquide appelé distillat peut être récupéré avec une concentration élevée du composé le plus volatil. DISTILLATION CHROMATOGRAPHIE Distillation simple sans la colonne à fractionner, souvent utilisée par les chimistes. 1. source de chaleur (ici, un brûleur Bunsen ; 2. ballon à distiller ; 3. tête de distillation ; 4. Thermomètre ; 5. réfrigérant à eau ; 6. entrée d'eau de refroidissement ; 7. sortie d'eau de refroidissement ; 8. ballon de réception des gouttes de distillat ; 9. vers une pompe à vide éventuelle ; 10. adaptateur pour la pompe à vide Sépare les constituants d un mélange par entraînement à l aide d une phase mobile liquide ou gazeuse (éluant le long d une phase stationnaire (solide ou liquide qui porte les solutés à traiter. La migration, qui entraîne le soluté (fonction de sa solubilité dans l éluant, et la rétention, qui retient le soluté (fonction de son affinité pour la phase stationnaire, sont les deux forces mises en jeu. La vitesse et la distance de migration est fonction de la résultante de ces 2 forces et est variable selon les substances. Page 5

6 La fixation des molécules dissoutes sur la phase solide résultent de liaisons électrostatiques faibles. La séparation des molécules du mélange est due à la résultante des forces de liaison à la phase solide et de leur solubilité dans la phase mobile (phase stationnaire solide- phase mobile liquide. L analyse des résultats se fait par comparaison du rapport frontal (Rf cas de la CCM. On peut aussi représenter la courbe (cas d une chromato sur colonne : Q (molécule intérêt = f (volume d élution - : cf partie analyse quantitative. ADSORPTION CHROMATOGRAPHIE GEL FILTRATION = EXCLUSION DIFFUSION = TAMISAGE MOLECULAIRE La phase stationnaire est un solide poreux dans lequel les petites molécules peuvent pénétrer alors que les grosses particules en sont exclues. Les produits sont donc élués en ordre inverse de leur masse molaire. On peut représenter la courbe : Q (molécule intérêt = f (volume d élution - : cf partie analyse quantitative. PARTAGE La séparation des constituants du mélange est fonction de leurs solubilités respectives entre les 2 phases (phase stationnaire liquide phase mobile liquide les 2 phases ne sont pas miscibles entre elles : caractérisées par leur différence de polarité et leur non miscibilité. L analyse des résultats se fait par comparaison du rapport frontal (Rf. On peut tracer la courbe Q (molécule intérêt = f (distance de migration : cf partie analyse quantitative Page 6

7 ECHANGE D IONS La phase stationnaire solide est une résine porteuse de groupements ionisés qui peut échanger de façon réversible ses ions avec certains solutés ioniques du milieu à analyser (phase mobile liquide. AFFINITE La phase stationnaire est un support inerte porteur d un agent fixateur (ligand de structure complémentaire à celle du composé à retenir. Les différentes associations entre ligand et soluté : E- effecteur ; Ag Ac ; H R ; virus R P = méthode préparative A = méthode analytique Page 7

8 TABLEAU COMPARATIF DES TECHNIQUES Caractéristiques Techniques - Dialyse (1 Simplicité Rapidité Coût 1<4<2 Pureté du produit final Efficacité (rendement Taille moléculaire - Electrophorèse (2 -Chromato exclusion (3 - Centri (4 <3 1<3<2<4 1<4<2<3 1<3< <2<4 Mais tous impurs 2<3<(4;1 Mise en œuvre dé Spécificité de liaison -Chromato affinité Licate Suffisante Cher 100% 100% Solubilité -relargage (1 - chromato partage (2 - chromato adsorption (3 2<3<1 (mais 1 suivi de centri 1<2 (2;3<1 1<2<3 (2;3<1 (2 ;3<1 Charge -Chromato échange d ion (1 - Electrophorèse (2 1<2 2< ou =1 Idem = f(conditions 2<1 Adsorption Chromato adsorption Simple Rapide Bon marché Qq impureté Correct pr méthode analytique Densité /poids Centrifugation Simple Bonne Centrifugeuse assez couteuse Correcte Correcte Volatilité Distillation Simple Suffisante Bon marché Nécessite plusieurs cycles Diminue si nb de cycle augmente Page 8

9 Activité n 2 : Exposé à l'ensemble de la classe Objectifs Analyser et comprendre le principe de chaque technique proposée à l étude. Communiquer. Durée conseillée minutes Consignes Expliquer à vos camarades le principe de chacune des techniques étudiées. Au fur et à mesure des exposés : - l enseignant clarifie les explications, si nécessaire ; - les élèves complètent le 1 er tableau (principe de techniques. Activité n 3 : Correction Objectifs Comparer les différentes techniques. Durée conseillée minutes Consignes Compléter le tableau comparatif en classe entièree (toute la classe participe à la correction Page 9