CCP-Ab ELISA RE C. Fiche technique
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- Geneviève Élise Bergeron
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1 Fiche technique CCP-Ab ELISA Test immuno-enzymatique pour le dosage quantitatif des anticorps IgG contre peptide citrulliné cyclique (CCP) dans le serum et plasma humains.. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)
2 1. BUT DU TEST Le test immuno-enzymatique est pour le dosage quantitatif des anticorps IgG contre peptide citrulliné cyclique (CCP) dans le serum et plasma humains. 2. SOMMAIRE ET INTRODUCTION La polyarthrite rhumatoïde (PR) est le plus souvent diagnostiquée par la mesure de facteurs rhumatoïdes (FR). Le facteur rhumatoïde est un anticorps anti-igg dirigé contre le fragment Fc. Il apparaît principalement comme anticorps IgM, mais également comme IgA ou IgG. Les facteurs rhumatoïdes sont présents dans les sérums de 80 % des patients souffrant de polyarthrite rhumatoïde. Leur présence n'est cependant pas spécifique à la PR, puisqu'ils se retrouvent également chez des personnes en bonne santé. L'incidence de cette maladie est fonction de l'âge : chez les personnes jeunes, elle se situe entre 1 et 4 %, tandis que chez les personnes plus âgées elle peut atteindre 25 %. Comparés aux facteurs rhumatoïdes seuls, les anticorps anti-ccp présentent l'avantage d'une sensibilité et d'une spécificité supérieures dans le diagnostic de la polyarthrite rhumatoïde. Les anti-ccp sont souvent présents à des stades très précoces de la maladie. Cette présence a par ailleurs une haute valeur prédictive pour le développement de celle-ci. 3. PRINCIPE DU TEST Dans une première étape, les CCP AAb provenant de l'échantillon dilué (ainsi que des calibrateurs et du contrôle) se lient aux peptides cycliques citrullinés dont la plaque de microtitrage est revêtue. Après une incubation de 60 minutes à température ambiante, les composants non liés sont éliminés par lavage. À l'étape suivante, les anticorps liés réagissent avec le complexe anti-igg humain peroxydase de raifort (HRP) ajouté. L'excès de conjugué est éliminé après 30 minutes à température ambiante par un second lavage. Le complexe HRP transforme le substrat TMB incolore ajouté en un produit bleu. La réaction enzymatique est arrêtée par l'ajout d'une solution acide après 15 minutes à température ambiante. La couleur vire du bleu au jaune. L'absorbance du produit obtenu est mesurée à 450/620 nm dans les 30 minutes. La DO obtenue est directement proportionnelle à la quantité d'anticorps liés. 4. PRECAUTIONS D EMPLOI 1. A l usage professionnel. 2. Lire les instructions complètement et avec attention avant de commencer le test. Utiliser la version valide de la fiche technique incluse dans le kit. S assurer que tout a été bien compris. 3. Dans le cas de dommages importants de l emballage du kit, veuillez contacter IBL ou votre fournisseur sous forme écrite, une semaine au plus tard après avoir reçu le kit. N utilisez pas les composants abîmés pour un test, mettez-les de côté et en sécurité pour les besoins éventuels liés à la plainte. 4. Suivez le numéro du lot et la date de péremption. Ne pas mélanger les réactifs de différents lots. Ne pas utiliser de réactifs périmés. 5. Suivre les bonnes pratiques de laboratoire et les directives de sécurité. Porter des blouses de laboratoire, gants en latex à usage unique et lunettes de protection si nécessaire. 6. Les réactifs de ce kit contiennent du matériel dangereux pouvant irriter les yeux et la peau. Consulter le MATERIEL FOURNI et les étiquettes pour les détails. Les Fiches de Données de Sécurité pour ce produit sont disponibles sur le site Internet IBL ou sur demande particulière à IBL. 7. Les réactifs chimiques préparés ou utilisés doivent être traités comme matériel dangereux en accord avec les directives et règlements nationaux de sécurité pour tout matériel à risque. 8. Eviter tout contact avec la solution d arrêt. Elle peut provoquer des irritations et brûlures cutanées. 9. Tous les réactifs doivent être conservés à 2-8 C dans leur emballage d origine jusqu à leur utilisation 10. Quelques réactifs contiennent de l azide de sodium (NaN 3 ) comme conservateur. En cas de contact cutané ou avec les yeux, rincer immédiatement avec de l eau. NaN 3 peut réagir avec le plomb et le cuivre pour former des azides métalliques explosifs. Pour l élimination des réactifs, rincer avec une grande quantité d eau pour éviter la formation de ces azides. 11. Tous les réactifs de ce kit contenant des sérums ou plasma humains ont été testés et confirmés négatifs à HIV I/II, HbsAg et HCV. Tous les réactifs doivent être considérés comme potentiellement contaminants et utilisés en tant que tel. V-1_2010_08_20 1 / 6
3 5. STOCKAGE ET STABILITE Avant de sortir la microplaque de son emballage scellé, laissez-la arriver à la température ambiante pendant au moins 30 minutes. Les puits non utilisés doivent être conservés au froid et protégés contre l'humidité dans leur emballage d'origine. Soigneusement refermée, elle peut être utilisée pendant 8 semaines. Après son ouverture, la solution anti-igg humain - HRP reste stable jusqu'à 8 semaines à une température de 2-8 C. Évitez d'exposer la solution de substrat à la lumière. La date de péremption de composant figure sur son étiquette respective ; celle de la trousse complète se trouve sur l'étiquette de la boîte. Après réception, tous les composants de la trousse CCP-Ab ELISA doivent être conservés à une température de 2-8 C, de préférence dans la boîte d'origine. 6. COLLECTE ET STOCKAGE DES ECHANTILLONS Sérum, Plasma Observer les précautions habituelles de prises de sang. Il est important de préserver l intégrité chimique d un échantillon sanguin, de sa collecte jusqu à son analyse. Ne pas utiliser d échantillons fortement hémolysés, ictériques ou lipémiques. Les échantillons d apparence turbide doivent être centrifugés avant analyse pour éliminer toute particule gênante. Conservation: 2-8 C -20 C (aliquots) À conserver à l abri de la chaleur ou de la lumière directe. Stabilité: < 3 jours > 3 jours Eviter tout cycles de congélation / décongélation répétés. 7. MATERIEL FOURNI Les réactifs fournis dans ce kit suffisent pour 96 dosages. Ceci correspond à l analyse en double de 42 échantillons inconnus, des étalons et sérums de contrôle. Quantité Symbole Composant 1 x 12 x 8 MTP Microplaque Barrettes sécables. Coatée avec de la peptides synthétiques avec résidus citrullinés. 1 x 15 ml ENZCONJ Conjugué Enzymatique Prêt à l emploi Contient: IgG anti humain (mouton) Complexe anti-igg humain (mouton) peroxydase de raifort (HRP). 5 x 1 ml CAL Etalon 1-5 Prêt à l emploi Consulter les concentrations exactes sur les étiquettes des flacons ou sur le certificat CQ. 1 x 1 ml CONTROL+ Contrôle Positif Consulter les concentrations exactes sur les étiquettes des flacons ou sur le certificat CQ. 1 x 1 ml CONTROL- Contrôle Négatif Consulter les concentrations exactes sur les étiquettes des flacons ou sur le certificat CQ. 1 x 100 ml SAMPLEDIL Diluant pour Echantillons Prêt à l'emploi. 1 x 100 ml WASHBUF CONC Tampon de Lavage, Concentré (10x) Suffisamment pour 1000 ml. 1 x 15 ml TMB SUBS Solution Substrat TMB Prêt à l emploi. Contient: 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine. 1 x 15 ml TMB STOP Solution d Arrêt TMB Prêt à l emploi, incolore M H2SO4. Le kit CCP-Ab ELISA est artificiellement calibré, pour cette raison les concentrations des anticorps anti- CCP sont exprimées en U/mL. Ces unités corrèlent avec un facteur constant de 1:12 avec le standard de référence WHO W1066 pour l arthrite rhumatoïde. V-1_2010_08_20 2 / 6
4 8. MATERIEL NECESSITE MAIS NON FOURNI 1. Pipettes précision µl 2. Multi-channel pipette avec jetable pipette tips 3. Bouteille pour lavage système automatique ou semi-automatique pour le lavage de microplaque 4. Lecteur de microplaque capable de lire l absorbance à 450 nm et 620 ou 690 nm 5. Cylindres gradués 6. Eau bidistillée ou désionisée 7. Papier absorbant ou serviette 8. Tubes (2 ml) pour la dilution des échantillons 9. Feuille 9. NOTES POUR LA PROCEDURE 1. Toute manipulation impropre des échantillons ou modification de la procédure du test peut influencer les résultats. Les volumes indiqués pour pipeter, les temps d incubation, températures et étapes de prétraitement doivent être strictement suivis selon les instructions. N utiliser que des pipettes et appareils calibrés. 2. Une fois que le test a commencé, toutes les étapes doivent être suivies sans interruption. S assurer que les réactifs, matériels et appareils nécessaires soient prêts au moment approprié. Amener tous les réactifs et échantillons à température ambiante (18-25 C) et mélanger doucement en tournant flacon de réactif liquide et d échantillon avant emploi. Mélanger les réactifs sans former de mousse. 3. Eviter toute contamination des réactifs, pipettes et puits/tubes. Utiliser des nouveaux embouts de pipette en plastique pour réactif, étalon ou échantillon. Ne pas interchanger les bouchons. Toujours refermer les flacons non utilisés. Ne pas réutiliser les puits/tubes ou réactifs. 4. Il est recommandé de doser les échantillons en double pour pouvoir identifier d éventuelles erreurs de pipetage. 5. Le temps d incubation affecte les résultats. Tous les puits doivent être manipulés dans le même ordre et aux mêmes intervalles. Il est recommandé d utiliser une micropipette à 8-canaux pour pipeter les solutions dans tous les puits. 6. Le lavage de la microplaque est important. Des puits mal lavés donneront des résultats erronés. Il est recommandé d utiliser une pipette à multicanaux ou un système de lavage automatique. Ne pas laisser sécher les puits entre les incubations. Ne pas gratter les puits coatés pendant le rinçage et l aspiration. Rincer et remplir les réactifs avec soin. Lors du rinçage, vérifier que tous les puits soient bien égouttés du tampon de lavage, et que les puits ne contiennent aucun résidu. 7. L humidité affecte les puits/tubes coatés. Ne pas ouvrir le sachet avant que celui-ci n ait atteint la température ambiante. Les puits/tubes inutilisés doivent être rangés immédiatement dans le sachet refermé avec le dessiccateur. 10. PREPARATIONS PREALABLES AU TEST Préparation de Composants lyophilisés ou concentrées Diluer / dissoudre Composant Diluant Relation Remarques Stockage Stabilité Rechauffer à 50 ml WASHBUF avec Eau 37 C pour jusqu'à C CONC 450 ml bidist. dissoudre les 30 jours cristaux. Laisser le coffret revenir à température ambiante (18-25 C). Bien homogénéiser les échantillons les échantillons sériques en les agitant doucement Dilution des Echantillons Dilution des Echantillons Echantillon À être dilué avec Relation Remarques Sérum ou En général SAMPLEDIL Par ex. 5 µl échantillon µl SAMPLEDIL plasma V-1_2010_08_20 3 / 6
5 11. PROCEDURE DU TEST 1. Pipeter 100 μl de Etalon, Contrôle et échantillon dilué dans les puits respectifs de la microplaque. 2. Couvrir la plaque avec une feuille adhésive. Incuber 60 min à TA (18-25 C). 3. Egoutter l excès de solution en frappant la plaque retournée sur du papier absorbant. Laver la plaque 3 x avec 300 μl de Tampon de Lavage dilué et laisser agir pour 5 secondes. 4. Pipeter 100 μl de Conjugué Enzymatique dans puits. 5. Couvrir la plaque avec une feuille adhésive. Incuber 30 min à TA (18-25 C). 6. Egoutter l excès de solution en frappant la plaque retournée sur du papier absorbant. Laver la plaque 3 x avec 300 μl de Tampon de Lavage dilué et laisser agir pour 5 secondes. 7. Utiliser une micropipette à 8 canaux si possible pour l ajout des solutions substrat et d arrêt. Pipeter ces solutions à la même cadence. Utiliser un déplacement positif et éviter la formation de bulles d air. 8. Pipeter 100 μl de Solution Substrat TMB dans puits. 9. Incuber 15 min à TA (18-25 C) dans le noir. 10. Arrêter la réaction substrat en ajoutant 100 μl de Solution d Arrêt TMB dans puits. Agiter la plaque rapidement. 11. Mesurer la densité optique avec un photomètre à 450 nm entre 620 ou 690 nm dans les 30 min suivant l ajout de la Solution d Arrêt. 12. CONTROLE QUALITE Les résultats du test ne sont valides que si l essai a été réalisé en suivant les instructions. De plus, l utilisateur doit strictement suivre les règles de bonne pratique de laboratoire (GLP, Good Laboratory Practice) ou autres lois/standards applicables. Tous les contrôles du kit doivent être trouvés dans les gammes acceptables indiquées dans les étiquettes. Si ces critères ne sont pas remplis, le test est non valide et il doit être répété. Chaque laboratoire devrait utiliser des échantillons connus comme contrôle supplémentaire. En cas de déviation des résultats, vérifier les origines éventuelles techniques: dates de péremption des réactifs (préparés), conditions de stockage, pipettes, appareils, conditions d incubation et méthodes de lavage. 13. CALCUL DES RESULTATS Evaluation quantitative Nous conseillons de procéder à un ajustement à 4 paramètres. La courbe standard est établie en marquant les valeurs de DO moyennes des calibrateurs 1-5 sur l'axe des ordonnées, y, et leurs concentrations CCP-Ab respectives sur l'axe des abscisses, x (échelle logarithmique). Les concentrations CCP-Ab des contrôles et des échantillons dilués inconnus sont lues directement en U/mL à partir des valeurs DO450 mesurées. Il n'est plus nécessaire de corriger la dilution. CCP-Ab ELISA peut également être utilisé dans le cadre d'analyses assistées par ordinateur, avec un logiciel capable d'ajuster la fonction de lissage spline. Courbe Etalon Typique (Exemple. Ne pas utiliser pour vos calculs!) Etalon DO (a) DO (b) DO (moyenne) U/mL Patient Echantillon /620 nm OD 3,000 2,500 2,000 1,500 1,000 0,500 0, U/ml V-1_2010_08_20 4 / 6
6 Les échantillons montrant une DO supérieure au standard 5 doivent être davantage dilués avec du diluant pour échantillon. La concentration en anticorps anti-ccp doit être multipliée avec le facteur de dilution. 14. INTERPRETATION DES RESULTATS CCP-Ab ELISA Gamme Interprétation < 30 U/mL négatif 30 U/mL positif Les résultats ne peuvent pas être l unique raison de conséquences thérapeutiques. Ils doivent être corrélés à d autres observations cliniques et tests diagnostics. Il est recommandé que laboratoire établisse ses propres gammes de valeurs de référence normales et pathologiques pour les taux d'anticorps anti-ccp des sérums, en suivant la procédure habituelle pour d'autres paramètres de diagnostic. Pour cette raison, les valeurs de référence ci-dessus ne sont données qu'à titre indicatif. 15. LIMITES DE LA PROCEDURE Le test CCP-Ab ELISA devrait être négatif dans le cas de personnes en bonne santé. Toutefois, les autoanticorps CCP peuvent également être présents chez des personnes apparemment en bonne santé. 16. PERFORMANCE Linéarité Sur la base de la nature hétérogène de la population d'auto-anticorps et au vu de la spécificité et de l'affinité qui caractérisent les auto-anticorps dans leur reconnaissance des épitopes, les valeurs théoriques attendues par dilution avec du sérum humain ne contenant pas d'anti-ccp correspondent le plus souvent aux concentrations mesurées. Spécificité et sensibilité Les résultats disponibles font apparaître une sensibilité clinique de 79 % à une spécificité de 97 % pour le diagnostic de la polyarthrite rhumatoïde. Limites de détection La sensibilité analytique (limite inférieure de détection, DS) a été établie à 1,2 U/mL. La sensibilité fonctionnelle a été mesurée au niveau de 20 % du CV inter-analyses à env. 2 U/mL. Intra- et inter-essai variation Intra-Essai Inter-Essai Concentration Concentration Echantillons no. moyenne CV (%) Echantillons no. moyenne CV (%) (U/mL) (U/mL) V-1_2010_08_20 5 / 6
7 17. ESSAI SCHEMA Avant de commencer le test, ramener tous les composants requis à température ambiante (18-25 C). Bien homogénéiser les réactifs en les agitant doucement. Diluer tous les échantillons (v+v) avec du diluant pour échantillons. Etape Activité Matériel CAL Contrôle Patient échantillons dilués 1, 2 etc. 1 Pipeter Echantillons 100 µl 100 µl 100 µl 2 Incuber Plaque 1 heure à AT (18-25 C) 3 Aspirer ou décanter Pipeter Tampon de Lavage egoutter prudent sur du papier absorbant 4 Pipeter Conjugué Enzymatique 100 µl 100 µl 100 µl 5 Incuber Plaque 30 min à TA (18-25 C) 6 Aspirer ou décanter Pipeter Tampon de Lavage egoutter prudent sur du papier absorbant 7 Pipeter Substrat 100 µl 100 µl 100 µl 8 Incuber Plaque 15 min à TA (18-25 C) dans le noir 9 Pipeter et agiter Solution d Arrêt 100 µl 100 µl 100 µl 10 Mesurer DO à 450 nm entre 620 nm (ou 690 nm) dans les 30 min 18. LITTERATURE DE REFERENCE DU PRODUIT 1. Zendman A. J. W. et al. Use and significance of anti-ccp autoantibodies in rheumatoid arthritis. Rheumatology 2006;45:20 25 (2005) 2. Smith JB et al. Rheumatoid arthritis - a molecular understanding. Ann Intern Med 136: (2002). 3. Schellekens GA et al. The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citrullinated peptide. Arthritis Rheum 43: (2000). 4. Schellekens GA et al. Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest 101: (1998). V-1_2010_08_20 6 / 6
8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.5 /
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