Introduction générale sur la cytogénétique humaine

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1 Introduction générale sur la cytogénétique humaine Branche qui étudie le matériel génétique au plan morphologique (étude des chromosomes) La cytogénétique moléculaire utilise des sondes ad hoc. Les chromosomes ne sont visibles que de la prophase à la métaphase, qui correspond au maximum de leur condensation. Les chromosomes ne sont étudiés que lors de la métaphase. Il existe des points de contrôle dans le cycle cellulaire, ayant une action directe sur la mitose. 2 étapes nécessaires à l étude cytogénétique : -Colchicine : bloque la mitose au niveau de la métaphase, les chromosomes sont au maximum de leur condensation. -Solution hypotonique : permet l étalement des cellules qui éclatent, et les chromosomes (22 paires d autosomes et une paire de gonosome) sont observables. Le chromosome en métaphase présente : -2 télomères, -2 chromatides réunis par un centromère -1 bras court p et un bras long q. Techniques de bande 1) bande Q (quinacrine) : différenciation en bande claire et sombre, ce qui permet d identifier les chromosomes en fonction de leur longueur. 2) bande C (chromatine constitutive : centromère) : elle correspond à une chromatine condensée. 3) Bande G (Giemsa) : les bandes G et C se correspondent approximativement. 4) Bande R (reverse) : les bandes sombres R correspondent au bandes claires G ; les bandes claires R au bandes sombres G. Les bandes claires donnent un meilleur marquage des extrémités, mais sont moins précises. Bande G Riche en AT Pauvre en gènes Pauvre en séquence Alu Riche en LINEs Réplication tardive Cassure moins fréquentes Bande R Riche en GC Riche en gène Riche en séquences Alu Pauvre en LINEs Réplication précoce Cassures fréquentes Ces techniques de bandes permettent d affirmer des translocations. 1

2 Nomenclature (Paris 1971) p= bras court q= bras long Sur chaque bras, on désigne des territoires numérotés de 1 à n, à partir du centromère. Ces territoires désignent des régions. Il y a également des sous région. Prenons un exemple : 9q3.4, désigne sur le bras long du chromosome 9, la région 3 et la sousrégion 4. Il existe 330 bandes /génome neutre, et 3*10ˆ9pdb/génome neutre, donc 1 bande = 10ˆ7 pdb (cette résolution est moins précise qu en génétique moléculaire). Autre technique : la fiche multi-couleur. Chaque chromosome est marqué par une couleur différente, ce qui permet leur identification (la paire 1 en vert, la 2 en rouge ). On peut également utiliser des techniques qui colorent chaque bande différemment. Comparative genomic hybridation : cette technique permet de mettre en évidence des anomalies qualitatives. Cette technique est très utilisée pour étudier des remaniements de tumeurs, mais aussi des variations du génome. Variantes dites normales du génome Il existe des tailles variables de bande C (sans pour autant être pathologiques), ce sont des marqueurs familiaux qui s héritent selon les lois de Mendel. Ces différentes variantes ont permis de localiser le gène Rh sur le chromosome 1. Cytométrie de flux : une suspension de chromosomes colorés par des fluorochromes spécifiques d une région donnée est éclairée par des lasers. Cette technique permet une quantification : chaque chromosome fluorescent est dénombré. Très utilisé pour l observation de lignées : un chercheur doit s assurer à chaque étape qu il travaille bien sur la bonne lignée de cellules, par ex 49 XYYYY (dénombrement d une anomalie des Y dont la proportion est trop importante). Etude des anomalies chromosomiques Ces anomalies chromosomiques peuvent être de 2 types : -constitutionnelles, c est-à-dire initialement présente au stade zygote, dès les premières divisions cellulaires comme la trisomie 21 -acquises, ne concernant que quelques cellules, comme les tumeurs. La trisomie 21 correspond à une non-disjonction méiotique (méiose 1 ou 2) du chromosome 21. La trisomie 21 peut être une anomalie en mosaïque. Dans ce cas, la non-disjonction n a pas lieu lors de la méiose, mais au cours de la mitose (zygote), ce qui donne 2 populations : -des cellules à 3 chromosomes 21 -des cellules normales à 2 chromosomes 21. A noter : pas de cellules à 1 chromosome 21, car elles ne sont pas viables. 2

3 La notion de mosaïque est à différencier de celui de chimères : dans un même organisme, 2 populations de cellules, mais qui se rencontrent lors de greffe de moelle (il ne s agit pas d un accident naturel, mais de quelque chose qui n est pas naturel d où son nom de chimère). Trisomie 21 -anomalie de dosage génétique par non-disjonction méiotique -on cherche à définir la région «critique», responsable lorsqu elle est en 3 exemplaires, du faciès, de la débilité et des malformations. -vieillissement précoce (Alzheimer) : beaucoup de gènes qui sont exprimés ne sont pas sur le chromosome 21. Le chromosome 21 est responsable de modification de l expression génique (gènes sur autres chromosomes). -prédisposition à des maladies malignes. Anomalies de structure : -perte de chromosome -chromosome en anneau : structure instable siège de remaniement -translocation : -équilibrée (phénotype normal) ou non -réciproque (échanges entre 2 chromosomes) -inversion -isochrome (chromosome formé de 2 bras long, perte du court) : le résultat final équivaut à une monosomie pour le court puisque l un des bras court est perdu et à une trisomie du long -translocation robertsonnienne entre 14 et 21 (on aboutit à un chromosome formé des bras long du 14 et 21). Caryotype à 45 chromosomes. -translocation réciproque : le bras long du 18 se retrouve sur le bras court du 20, et réciproquement ; On estime les anomalies chromosomiques chez les nouveau-nés vivants à 0.65 %. Syndromes contigus : une région est délétée. Or de très nombreux gènes sont situés dans cette région et dans son immédiate proximité. La cytogénétique ne permet de déterminer avec une grande précision quelle région exacte est touchée à la pdb près comme en moléculaire du fait de sa précision. Les signes observés sont très différents en fonction des gènes délétés. Cependant il s agit bien de la même délétion sur le même chromosome. Les sondes sub-télomériques permettent de détecter ces anomalies par FISH. Télomères Muller a émis l hypothèse des télomères pour expliquer que les chromosomes ne fusionnaient pas entre eux. -(TTAGGG) n -il existe des différences de longueur entre chromosome homologue (polymorphisme) -le maintien des télomères est indispensable pour assurer la stabilité des chromosomes -raccourcissement des télomères avec division cellulaire Centromère -marqués par des sondes centromériques -fonction : attachement au fuseau, migration, cohérence des chromatides Diagnostic prénatal : à noter, l examen sur le sang maternel : des cellules fœtales passent dans le sang maternelle, elles sont alors étudier. 3

4 Chromatine sexuelle Baar a découvert qu il existait chez les noyaux de femme un corpuscule correspondant à l inactivation de l un des chromosomes X. Il n y a pas de corpuscule chez les hommes et chez le patient TURNER 45 X. Il y a dans une cellule n-1 corpuscules de Baar (n étant le nombre de chromosomes X d une cellule). Par des méthodes cytogénétiques, on peut identifier quel X est inactivé. L inactivation de l X a lieu pendant la période fœtal à partir du centre d inactivation Xist et selon un gradient (inactivation graduelle des gènes à partir du Xist). Mécanisme d inactivation par méthylation, acétylation Sites fragiles Locus prenant mal la coloration (gap), ayant une tendance à former des lacunes, hérités selon Mendel co-dominant, donnant des délétions. Il existe un site fragile de l X, dont la délétion donne chez l homme une débilité. Ces sites fragiles sont des lieux d insertion virale, où il y a beaucoup de séquences répétées. Effet de position : le remaniement ne se situe pas dans une région codante, mais dans une séquence régulatrice de gènes Syndrome d instabilité chromosomique Il existe des remaniements non systématisés : -anémie de Fanconi : 13 gènes identifiés, insuffisance médullaire progressive -ataxie-télangiectomie : ATM est un gène clé dans la réparation de l ADN ; muté, il n est plus capable de réparer les mutations qui s accumulent -syndrome de Bloom : prédisposition aux tumeurs solides : 1 gène impliqué codant une hélicase Transmission de ces gènes sur un mode autosomique récessif Mutagénèse 2 causes : -agents chimiques -radiations ionisantes La dosimétrie biologique permet de quantifier la dose reçue en fonction des mutations dans le cas d une radiation aigue. Effet «bystander» : des anomalies peuvent apparaître dans des cellules qui n ont pas été directement exposées, ce qui est très fortement soupçonné dans des lignées animales. Echanges de chromatides sœurs Technique qui consiste à l exposition au BudL, s insérant dans la chromatide avant la réplication. Par la suite, la chromatide mère (celle qui est la plus ancienne et a servi de matrice au brin fille) ayant incorporé l agent apparaît en foncé. La chromatide fille (crée par la réplication, complémentaire au brin mère) n ayant pas incorporé l agent apparaît en clair. Cette technique permet en outre de quantifier les échanges de chromatide suites à une exposition mutagène. On expose une lignée au BudL : les cellules filles ont des chromosomes dont la chromatide est constituée d un brin mère foncé ayant incorporé l agent et d un brin fille clair, n ayant pas incorporé l agent. On expose cette lignée à une radiation qui induit des cassures : le brin mère peut recevoir un morceau du brin fille et vice versa. Suite aux cassures, 4

5 les brins mutés apparaissent à la fois clair et foncé car ils sont faits et de chromatides mères et de chromatides filles échanges entre chromatides. Anomalies chromosomiques acquises des hémopathies malignes En 1960, Nowell a décrit un petit chromosome retrouvé de manière récurrente dans la LMC. C était la première fois qu on établissait un lien entre une anomalie chromosomique et une maladie acquise. Dans ces hémopathies, certaines anomalies étaient plus fréquentes, comme dans la leucémie aigue pro-myélocytaire et t(15,17), le Burkitt et t(8,14)(q24,q32), t(2,8)(p12,q24) et t(8,22)(q24,q11). Ceci a permis de confirmer la localisation des gènes des Igs et d un oncogène en 8q24 : c-myc. Les anomalies chromosomiques des hémopathies acquises sont : -acquises -clonales -non aléatoires -numériques et/ou structurales -primaires (proche d un évènement causal) ou secondaires Aneuploïdie : nombre anormal de chromosome dans une cellule, du à la division aberrante mitotique. Différents mécanismes expliquent les anomalies structurales acquises : -défaut de cohésion chromosomique -défaut d attachement au fuseau -défaut de réponse au point de contrôle de la mitose -défaut de cytokinèse -amplification du centrosome. Anomalies chromosomiques de structure acquises 2 conséquences : -fusion de chromosome aboutissant à un gène chimérique (ex le gène Bcr-Abl du à la t(9,22) (chromosome Philadelphie) dans la LMC codant pour une tyrosine-kinase, cible thérapeutique du Glivec) -dérégulation d expression génique : Burkitt et c-myc. Ces hémopathies ont permis de localiser des gènes. 5