Spectrométrie de masse

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1 Spectrométrie de masse

2 Introduction technique de détection extrêmement sensible MAIS destructive détermination des structures moléculaires I - Principe ionisation : ion moléculaire Si rupture des liaisons chimiques fragments caractéristiques Séparation en fonction du rapport masse/charge (application d'un champ magnétique et/ou électrique) Collection des ions par un détecteur identification de la structure moléculaire

3 Le spectromètre de masse Le système d introduction La source d ions choix lié à la nature de l échantillon et au type d analyse souhaitée L analyseur : tri des ions fragments en fonction du rapport masse/charge Un détecteur : collecte les ions fragments et amplifie le signal associé aux ions Un ensemble informatique de traitement des données spectre de masse

4 Abondance des ions Allure d un spectre de masse Rapport m/z (masse/charge)

5 Les sources d ionisation Impact électronique Ionisation chimique FAB ESI

6 Sources à impact électronique (IE) analyse des gaz et des produits vaporisables tant organiques qu inorganiques P= Torr échantillon Vers analyseur Chambre d ionisation IE - Arrachement d un e M e M 2 e où M : ion radicalaire Capture d un e M e M - (1000 fois probable) Energie nécessaire : 10eV

7 Energie nécessaire : de 6 à 10eV Courant d ionisation stable 70eV gros excès d énergie fragmentations de l ion moléculaire : en fragments primaires, puis des fragments primaires en secondaires L Impact Electronique produit : ion parent = ion moléculaire masse moléculaire des ions fragments structure moléculaire Technique la plus ancienne Existence de banques de données traitement informatique des spectres obtenus

8 Introduction des échantillons en IE Echantillon : solide, liquide ou gazeux quantités de substance nécessaires :très faibles : (µg) pour des solides et de l'ordre du µl pour des liquides Selon l'état physique des échantillons : Introduction directe : pour les solides et les liquides à faible tension de vapeur substance placée dans un creuset en quartz chimiquement inerte placé à l'extrémité d'une canne porte-échantillon et introduit directement dans la chambre d'ionisation sublimation en fonction de la température Introduction liquide : pour les liquides très volatils Echantillon vaporisé au préalable dans une chambre externe Introduction des gaz : vanne de précision

9 Ionisation chimique Principe : faire réagir un ion réactif positif A ou négatif B formé en IE à partir d un gaz précurseur Le gaz précurseur : introduit séparément dans la chambre d ionisation OU mélangé avant introduction Différents gaz précurseurs possibles

10 Gaz précurseur = méthane Méthane P=1 torr Substrat 10-6 torr mélange Chambre à impact électronique Energie électrons assurant l ionisation du gaz précurseur de 100 à 500 ev (1) CH 4 e - CH 4 2 e- (2) CH4 CH4 CH 5 CH 3 avec CH 5 acide fort (3) CH 5 M [M-H] CH 4 m/z= M1 = ion pseudomoléculaire (2) Favorisée par pression élevée de méthane (3) Réaction acido-basique

11 -autre gaz d ionisation NH 3 (1) NH 3 e- NH 3 2 e- (2) NH 3 NH 3 NH 4 NH 2 (3) NH 4 M [M-H] NH 3 m/z= M1 = ion pseudomoléculaire

12 Caractéristiques de l ionisation Chimique le rendement global d ionisation voisin de celui de l IE Méthode plus douce que l impact électronique : sans excès d énergie peu de fragmentations Particulièrement adaptée aux molécules thermiquement fragiles méthode complémentaire de l impact électronique ions «pseudo-moléculaires» [comme les ions (M H) ou (M H) de masse (m 1) ou (m 1) formés par échange de protons Avec IE la plus utilisée pour ioniser des substances de masse moléculaire inférieure à u

13 FAB(Fast Atomic Bombardement): bombardement par atomes rapides (1) Production de Ar Ar Ar IE (2) accélération et focalisation : Ar «rapides» (3) Neutralisation : «Ar rapides» «Ar lent» Ar rapide Ar lent (4) Bombardement par les Ar rapide des substances dissoutes dans une matrice déposée sur la cible ionisation douce du composé Rôle de la matrice : maintenir physiquement le composé et assister à l'ionisation de la molécule par protonation par exemple Types de matrice : le plus souvent ioniques : glycérol, le thioglycérol, ou l'alcool métanitrobenzylique (mnba)

14 Caractéristiques Facilité de mise en oeuvre Observation des ions moléculaires de masses très élevées (de l'ordre de uma) ionisation idéale pour les peptides et les petites protéines ions quasi-moléculaires comme (MH) (m/z=m1)ou adduits de type (MNa) (m/z= M23) ou (MK) ( m/z= M39),, si ions alcalins sont présents dans la source à l'état de traces

15 ESI : Electro Spray Ionisation : à pression atmosphérique Gaz nébulisant capillaire Gaz désolvatation N 2 Formation d un brouillard de gouttelettes polychargées Formation gouttelette chargée Augmentation tension surface Ion multichargé

16 Caractéristiques la plus douce de toutes les méthodes composé dissous dans une solution aqueuse Ionisation sous l action conjuguée d'un gaz nébuliseur (N2) et d'un champ électrique Obtention d un ion multichargé en phase gazeuse ions multichargés et multiprotonés détermination de molécules très lourdes parfaitement adaptée pour les protéines de haut poids moléculaire

17 Les analyseurs Les différents types d analyseurs Les secteurs magnétiques les filtres de masse quadripolaires les appareils à temps de vol Les principales qualités d un analyseur le pouvoir de résolution la gamme de masses détectable la précision sur la mesure d une masse la sensibilité la vitesse d acquisition

18 Pouvoir de résolution «le plus petit écart de masse qui permette encore de séparer, sur un enregistrement, les pics de masses m et m Dm» R= m/dm R M M M' * a b a=b alors R M M M'

19 Exemple de calcul Résolution minimum nécessaire pour séparer 2 ions dont les masses exactes sont connues m/z 28 : : CO : m/z 27,9949 N 2 : m/z 28,0061 Si R = 1000 (basse résolution) : ions confondus Si R = 2500, 2 pics distincts et séparés par un vallée de 10%

20 Secteur magnétique Un ion de : masse m de vitesse v de charge q (q = ze) v : Vitesse acquise avec potentiel accélérateur V Source d ionisation B r F v ½ m v 2 = qv dans un champ magnétique homogène B perpendiculaire à v : Force centripète (Force de Lorenz) : détecteur F= qvb=(mv 2 )/r trajectoire circulaire de rayon r: d où r 2 = 2V m/qb 2 soit m/q=(b 2 r 2 )/2V

21 Filtre quadripolaire faible accélération des ions (centaine de volts seulement) séparation des ions suivants leur rapport m/z avec une résolution unitaire sensibilité faible pour les ions de masse supérieure à 2000 uma pas de détermination des masses exactes des ions système compact et peu coûteux attribution des structures par comparaison bibliothèque de spectres

22 Analyseur à temps de vol TOF: Time Of Flight : L source ionique Tube de vol Détecteur Principe : séparation des ions fondée sur leur différence de vitesse même énergie cinétique à la sortie de la source : W =1/2 mv 2 Vitesse légers > vitesse lourds Temps vol légers < Temps vol lourds faisceau "pulsé " d ions Caractéristique R= 3000 à 4000 principal avantage : aucune limitation en masse

23 Analyse organique masse moléculaire (et éventuellement analyse élémentaire) pics caractéristiques de fonctions chimiques Ces données dépendantes de la méthode d ionisation utilisée Masses moléculaires En mode impact électronique : Pic moléculaire : pic de m/z le plus élevé = Parfois absent du spectre de masse si si fragmentation aisée de l ion moléculaire méthodes d ionisation «douces» : ionisation chimique, ESI pics pseudo-moléculaires (pics se détachant nettement et constituant même parfois l élément essentiel du spectre)

24 Règle de l azote : Molécule composée C, H, O, N Si n N et : pair alors : masse moléculaire paire dc m/z (M ) pair tous les m avec n N pair ont un m/z pair tous les ions X avec n N pair ont un m/z impair Si n N et : impair alors : masse moléculaire impaire dc m/z (M ) impair tous les m avec n N impair ont un m/z impair tous les ions X avec n N impair ont un m/z pair

25 Fragment de masse impaire issu d un ion moléculaire de masse paire : c est un ion X Même parité que ion moléculaire donc c est un ion radical m (comme l ion moléculaire) Ion moléculaire de masse paire dc n N pair

26 Détermination de la formule brute Par le biais des spectres haute résolution «peak matching» méthode limitée lorsque la masse de l ion s accroît : le nombre de combinaisons compatibles avec la masse observée augmente Par le biais du massif isotopique de l ion moléculaire Par le biais du massif isotopique Molécules avec C, H, N, O, F, P I M I I M I 1 *100 M 2 *100 M n c *11 ( n *11) c n N n o *036 *020 Abondance 13 C Abondance 16 O Abondance 15 N Si n C <2 ce terme est nul Faire hypothèse de départ avec la règle de l azote

27 Exemple : m/z Intensité 26 M M M2 0 Ion moléculaire = pic parent m/z = 26 : masse d une molécule avec isotopes léger = 26 uma Ion moléculaire de masse paire nombre d atomes d azote pair ici n N = 0 I M 1 22 *100 n *11 n *036 *100 n *11 0*0 I c N n c C = 2 M I M 2 *100 I M ( n *11) c n o *020 0 * ( n *11) c n o *020 n 200 O = 0 Masse moléculaire- masse de C masse d azote- masse d oxygène = masse d hydrogène 26 2*12 = 2 donc 2 atomes d hydrogène dans la molécule C 2 H 2

28

29 Cas des halogènes : Br et Cl 35 Cl/ 37 Cl : 3/1 79 Br/ 81 Br : 1/1 CH 3 Cl m/z isotope Intensité relative M 35 Cl 3 M2 37 Cl 1 M M2 CH 3 Br m/z isotope Intensité relative M 79 Br 1 M2 81 Br 1 M M2

30 CH 2 Cl 2 35 Cl/ 37 Cl : 3/1 a=3 b=1 m/z isotopes isotopes Intensité relative M 35 Cl 35 Cl 3 *3=9 a 2 M2 37 Cl 35 Cl 35 Cl 37 Cl 1*31*3=6 2ab M4 37 Cl 37 Cl 1*1 = 1 b 2 M M2 M4 CH 2 Br 2 79 Br/ 81 Br : 1/1 a=1 b=1 m/z isotopes isotopes Intensité relative M 79 Br 79 Br 1 *1=1 a 2 M2 79 Br 81 Br 81 Br 79 Br 1*11*1=2 2ab M4 81 Br 81 Br 1*1 = 1 b 2 M M2 M4

31 Si plusieurs isotopes d abondances naturelles non négligeables massifs isotopiques de pics caractéristiques de la composition élémentaire de la molécule Molécule contenant 2 atomes d abondances a et b et de masses m a et m b probabilité de trouver le pic localisé à : la masse M (2 atomes de masse m a ) égale à a 2, la masse M(m b -m a ) (1 atome m a et 1 atome m b ) égale à 2ab (facteur 2 car deux arrangements possibles des deux atomes) la masse M2(m b -m a ) (2 atomes de masse m b ) égale à b 2 développement du binôme (a b) 2 Généralisation : (ab) n si n atomes d isotopes d abondances relatives a et b

32 CH 2 BrCl 35 Cl/ 37 Cl : 3/1 a=3 b=1 79 Br/ 81 Br : 1/1 c=1 d=1 m/z isotopes isotopes Intensité relative M 79 Br 35 Cl 1 *3=3 a M2 81 Br 35 Cl 79 Br 37 Cl 1*31*1=4 2ab M4 81 Br 37 Cl 1*1 = 1 b 2 M M2 M4 (ab) (cd) = ac bcad bd 2 isotopes 1 isotope léger 2 isotopes légers 1 isotope lourd lourds M M2 M4 I relatives 3 4 1

33 Généralisation 35 Cl/ 37 Cl : 3/1 a=3 b=1 79 Br/ 81 Br : 1/1 c=1 d=1 Si n Cl et m Br (ab) n (cd) m Exemple : n=2 m=1 CHCl 2 Br (ab) 2 (cd) = (a 2 2abb 2 )(cd) = a 2 c a 2 d2abc b 2 c2abd b 2 d M M2 M4 M6 I relatives 9 96=15 16=7 1

34 Utilisation de bibliothèques de spectres pour l identification un composé (analyse qualitative) Essentiellement des spectres obtenus en mode IE Gestion des bibliothèques par un système informatique bonne connaissance de l interprétation des spectres de masse de manière à éviter les fausses attributions ou à identifier, par comparaison, un composé ne figurant pas dans la base de données

35 Les fragmentations en Impact électronique Origine des fragmentations Excès d énergie lors de l IE rupture des liaisons Les types de rupture a) Ruptures homolytiques b) Ruptures hétérolytiques Les types de fragmentations a) Fragmentations simples : rupture d une seule liaison b) Réarrangements : rupture simultanée de plusieurs liaisons

36 Principes généraux pour les fragmentations 1 er Principe : SSI exès d énergie fragmentations 2 ème Principe : Ion parent Fragments I aires Fragments Ii aire 3 ème Principe : 2 types de fragmentation Fragmentation simple = rupture d une liaison M X R Réarrangement : rupture simultanée de plrs liaisons M m N

37 4 ème Principe : nature des ruptures de liaison rupture homolytique X : Y Rupture hétérolytique X : Y 5 ème principe : ordre de facilité d arrachement des e - e - n > e - p > e - s

38 Les fragmentations simples Facteurs influençant les fragmentations simples rupture simple = processus unimoléculaire = processus thermodynamique Formation des produits les plus stables Facteurs de stabilisation?

39 Stabilisation des IONS = FACTEUR PREPONDERANT Délocalisation de la charge avec un doublet non liant CH 3 C O CH 3 C O avec un doublet liant CH 2 CH CH 2 CH 2 CH CH 2 Degré de substitution C > CH > CH 2 > CH 3

40 Exception à la règle du degré de substitution = fragmentation des alcanes 2 CH 3 3 C 2 H 5 C C 4 H H CH 3 CH 3 C 2 H 5 C C 4 H 9 C C 4 H 9 C 2 H 5 C C 4 H 9 CH 3 C 2 H 5 C H H H H C 2 H 5 CH 3 C 4 H 9 Théoriquement favorisé car Carbocation III Majoritaire car plus gros radical éjecté Règle de STEVENSON = exception pour les alcanes Perte du plus gros radical

41 Fragments des alcanes m/z = (masse CH 3 )n* masse (CH 2 ) = 15n * 14

42 Stabilisation des radicaux R Stabilisation de l e- célibataire par un atome électronégatif (Cl, O) CH 3 O > CH 3 Stabilisation par délocalisation de l e- célibataire CH 2 C CH 2 CH 2 CH CH 2 R R Stabilisation par substitution C > CH > CH 2 > CH 3

43 Stabilisation des molécules neutres N Formation de petites molécules de haute énergie d ionisation favorisée H 2, CH 4, H 2 O, C 2 H 4, CO,NO, CH 3 OH, H 2 S, HCl, CO 2

44 Stabilisation des ions radicaux Ions radicaux «distoniques» plus stables (site différent pour l e- célibataire et la charge) CH 3 CH 2 CH 2 CH O CH 2 CH 2 CH 2 CH O H CH 3 NH 2 Transfert d hydrogène Stabilité Transfert d hydrogène Stabilité CH 2 NH 3

45 Effets stériques ou effets d entropie M (R X ) ou m N Etat de transition? MAIS si l état de transition est trop contraignant La fragmentation ne se produit pas 1 er critère : Stabilité des produits formés Tension de cycle stabilité

46 Réactions initiées par le site radicalaire Force motrice de la fragmentation Création d une nouvelle liaison Rupture en a du site radicalaire Uniquement des ruptures homolytiques

47 R IE e - n > e - p > e - s Rupture en a /électron célibataire R H a H (2) ALCENES R R a et R m/z= 41 (1) a Stabilisation par résonance R a m/z= 27 Pas de stabilisation par résonance MAJORITAIRE R R Les 2 ions sont stabilisés H par résonance Le radical le plus gros sera éjecté R

48 ALCENES Rupture majoritaire = rupture allylique R R Stabilisation par résonance m/z= 41

49 Fragments des alcènes m/z des alcènes inférieurs de 2 uma/ m/z des alcanes

50 IE (2) a a a Ḥ R (1) (2) R Aromatiques IE e - n > e - p > e - s 1 seul site d ionisation pour ne pas ouvrir le cycle aromatique (1) R R H a m/z= 77 a Pas de délocalisation de la charge Forte délocalisation de la charge ET gros radical TROPYLIUM m/z= 91 Forte délocalisation de la charge mais petit radical R R

51 Aromatiques Rupture majoritaire = rupture benzylique Ion tropylium m/z= 91 Stabilisation par résonance

52 Amines (molécule avec hétéroatome porteur de doublet non liant) R CH 2 NH 2 IE e - n > e - p > e - s CH 2 NH 2 CH 2 NH 2 m/z= 30 R (2) H R ac NH 2 H (1) R CH NH 2 R CH NH 2 H Les 2 ions sont stabilisés par résonance, la fragmentation majoritaire est celle qui conduit au radical le plus stable

53 Amines m/z=30 caractéristique des amines Iaire Règle de l azote : n N impair alors m/z (X ) pair

54 Fragments des amines Les ions monoazotés ont des masses paires (règle de l azote)

55 Alcools (molécule avec hétéroatome porteur de doublet non liant) R CH 2 OH IE e - n > e - p > e - s CH 2 CH 2 m/z= 31 OH R OH (2) H (2) R C OH a H (1) R CH OH R CH OH H Les 2 ions sont stabilisés par résonance, la fragmentation majoritaire est celle qui conduit au radical le plus stable (1)

56 ALCOOLS m/z=31 caractéristique des alcools Iaire

57 m/z = 31 Fragment masse paire = réarrangement = 18 Perte d eau M (m/z= 74) absent : fragilité des alcools/ie

58 Fragmentations = mécanismes compétitifs, non exclusifs H CH 3 C OH IE e - n > e - p > e - s (2) H a CH 3 C OH (1) (3) C 2 H 5 H CH 3 C OH H > C OH > C 2 H 5 CH 3 C OH C 2 H 5 C 2 H 5 CH 3 C 2 H 5 (1) (2) (3) H

59 H Les cétones H CH 3 C C CH 3 (1) IE e - n > e - p > e - CH a s 3 C (2) C CH 3 O CH 3 H CH 3 C C CH 3 (1) CH 3 (1) C O (2) CH 3 CH CH 3 O CH 3 O CH 3 CH O C CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 C O m/z= 43 majoritaire

60 Les méthylcétones m/z= 43 majoritaire

61 m/z= 43 caractéristique methylcétone m/z pair donc ion radical issu d un réarrangement

62 Amides R C NH 2 O IE e - n > e - p > e - s Li Be B C N O F Ne électronégativité R a C NH 2 O R O C NH 2 m/z= 44 caractéristique des amides I R O C NH 2 R O C NH 2

63 Amides m/z (M ) pair

64 Les esters C 2 H 5 C O CH 3 a IE e- n C 2 H 5 C O CH 2 (1) C 2 H 5 (1) O O (1) C (2) a O H O CH 3 (2) C 2 H 5 C O CH 2 O H (1) IE e- n C 2 H 5 C O CH 3 C 2 H 5 a (1) (2) O O O O C C O CH 3 C O CH 3 O CH 3 Les 2 ions sont stabilisés par résonance Mais CH 3 -O stabilisé par atome électronégatif (2) C 2 H 5 C O O CH 3

65 Réactions initiées par la charge Attraction d une paire d e - par atome EN Rupture hétérolytique Effet d autant plus marqué que EN R Y favorisées que ruptures homolytiques

66 C 2 H 5 O C 2 H 5 C 2 H 5 O C 2 H 5 Idem avec R-NO 2, R-I, Bromures II, Chlorures III CH 3 R C C CH 3 R C O C O CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 m/z= 57 tertiobutyle

67 Idem avec les alcools III HO CH 3 C C CH 3 HO CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 m/z= 57 tertiobutyle

68 Ruptures hétérolytiques dans les ions = fragmentation IIaire R R C O Frgmt Iaire Homo R R C O Frgmt IIaire Hétéro R C O

69 Réarrangements Ruptures simultanées de plusieurs liaisons = Mécanisme concerté = état de transition (cyclique)

70 Réarrangement de Mac Lafferty Condition nécessaire : H en position 6 (ou g)/ insaturation R H O 1 5 g 6 Etat de transition à 6 centres 4 b a 3 2

71 R H O IE R H O Transfert H H R O Ion radical distonique plus stable Rupture homolytique Rétention de la charge H H R O R Migration de la charge H O R O Rupture hétérolytique Si R = CH3 : 40% Si R = F : 5% R H Si R = CH3 : 5% Si R = F : 100% O

72 R H H R H O 1 Rétention de la charge O O 5 g 4 b a 3 2 Migration de la charge R H O Avec : cétones, aldéhydes, nitriles, acides, esters, amides, époxydes, aromatiques

73 Réarrangement avec élimination d une molécule neutre Perte de : H 2 O dans les alcools H 2 S dans les thiols HX dans les halogénures d alkyle HCN dans les nitriles

74 R (CH 2 ) H O H IE R (CH 2 ) H O H Transfert H H R (CH 2 ) O H Ion radical distonique plus stable H R O H HOMOLYTIQUE R H 2 O (CH 2 ) (CH 2 ) m/z=18 OU H R O H HETEROLYTIQUE R H 2 O (CH 2 )

75 IE e - n > e - p > e - s a

76 IE e - n > e - p > e - s a

77 a

78 a