Passage de l électrophorèse sur gel à l électrophorèse capillaire

Dimension: px

Commencer à balayer dès la page:

Download "Passage de l électrophorèse sur gel à l électrophorèse capillaire"

Jean-Philippe Joly
il y a 6 ans
Total affichages :

1 Passage de l électrophorèse sur gel à l électrophorèse capillaire Dr Maurice Schmidt ADMED Analyses et diagnostics médicaux Neuchâtel-La Chaux-de-Fonds

2 L électrophorèse, une longue histoire de supports En veine liquide (Tiselius 1930) Papier filtre (membrane) Acétate de cellulose (membrane) Amidon (milieu gélifié) Agar-agar (milieu gélifié) Agarose (milieu gélifié) Polyacrylamide (gel) Capillaire de silice (veine liquide, < 100 µm, l: 8 cm)

3 Rappel des principes Charges des protéines Afin d être solubles dans un phase aqueuse, toute molécule doit pouvoir s entourer d une couche de molécules d eau. Dans le cas des protéines, cela dépend de leur capacité de ionisation. Cette ionisation dépend majoritairement des radicaux d aminoacides (R-COO- et R NH3 ) présents à la surface des molécules. Lorsque le ph du milieu est tel que le nombre de charges positives est égal au nombre de charges négatives, la protéine possède une charge globale nulle et ne migre pas lorsqu elle est soumise à un champ électrique, c est le point isoélectrique (pi). Les électrophorèses des protéines sériques de routine sont en général réalisées en milieu alcalin (ph > 8, >9.5 en électrophorèse capillaire), les protéines sont donc chargées négativement.

Electromigration Toute espèce chargée en solution et soumise à un champ électrique E se déplace à une vitesse linéaire appelée vitesse électrophorétique Ve Ve = µ x E, µ étant

4 Electromigration Toute espèce chargée en solution et soumise à un champ électrique E se déplace à une vitesse linéaire appelée vitesse électrophorétique Ve Ve = µ x E, µ étant la mobilité électrophorétique de l espèce dans le milieu considéré. Le transport des cations s effectue dans le sens du champ E et le transport des anions dans le sens opposé.

5 Facteurs influençant la migration La mobilité électrophorétique dépend de plusieurs facteurs: Charge électrique nette, celle-ci dépend de la différence entre le ph du milieu et le pi de chacune des particules Intensité du champ électrique Température Taille et géométrie de la molécule (forces de frottement) Viscosité du tampon Les courants liquidiens Courant d électrolyse Courant d évaporation (rhéophorèse) Courant d électro-endosmose (ou électro-osmose)

6 Courant d électrolyse Courants d électrolyse et d évaporation Par suite de l électrolyse qui se produit dans les cuves, la composition du tampon se modifie dans les compartiments des électrodes. Cela entraîne à la longue des modifications du ph des compartiments, perturbant les résultats. Courants d évaporation (rhéophorèse) Le passage du courant s accompagne d un échauffement du support (effet Joule), qui entraîne l évaporation de l eau de la phase liquide. Cet effet est maximum au milieu du gel. Ces deux phénomènes ne concernent que l électrophorèse sur gel

7 Le courant d électro-endosmose Les supports d électrophorèse (gel, capillaire) possèdent, aux ph opérationnels, plus ou moins de charges négatives (sulfates dans le cas de l agarose, silanolates dans le cas de l électrophorèse capillaire) Une couche mobile de charges positives se forme dans le solvant au contact du support et entraîne la phase liquide ves la cathode Dans le cas de l électrophorèse sur agarose (ou sur gel en général), on cherche à minimiser ce phénomène en utilisant de l agarose très pur Dans le cas de l électrophorèse capillaire, ce phénomène devient prépondérant dans la migration des protéines

Les cations de l électrolyte viennent se placer à la surface de la silice et forment une double couche diffuse.

8 Electro-endosmose en électrophorèse capillaire La paroi du capillaire de silice est tapissée de groupements silanols, qui s ionisent au dessus de ph 2. La surface du capillaire devient alors négative. Les cations de l électrolyte viennent se placer à la surface de la silice et forment une double couche diffuse. Dès qu on applique un champ électrique, les cations de la double couche se mettent en mouvement vers la cathode et entraînent les molécules de l échantillon. C est le flux électro-endosmotique. Il est prépondérant dans ce type d électrophorèse.

9 - +

10 Détection Gel: Fixation-coloration (amidoblack), densitométrie Avantages: Vision globale de la séparation, identification de protéines monoclonales faibles, pas d interférences par des molécules de faible poids moléculaire (médicaments, p.ex.) Inconvénients: Imprécision de la quantification des fractions (dépendance de l affinité des protéines pour le colorant, imprécision du densitomètre), qualité des résultats opérateurs-dépendants Capillaire: Détection de la liaison peptidique à 200 nm Avantages: Très bonne précision du dosage quantitatif des fractions, rapidité et reproductibilité, automatisation Inconvénients: Interférences médicamenteuses possibles,

11 Electrophorèse sur gel

13 Albumin Beta lipo TG Alpha-1 Alpha-2 Beta-1 Beta-2 fib Gamma

14 Interférences en électrophorèse capillaire Un certain nombre de substances absorbant dans l UV vers 200 nm peuvent interférer sur le pourcentage de certaines zones et/ou donner des pics surnuméraires. Il s agi essentiellement de: La vitamine B12 (majoration en zone alpha 1) Certains produits de contraste iodés (pics surnuméraire en zones alpha1, bêta1 ou 2) Les substituts plasmatiques à base de gélatine (majoration de la zone gamma) Les immunoglobulines polyvalentes intra-veineuses (majoration de la zone gamma) Et toute autre substance inconnue

15 Corrélation Albumine

16 Corrélation avec la néphélémétrie Il existe une très bonne corrélation entre les valeurs en g/l de certaines fractions de l électrophorèse (en particulier l albumine et les gamma-globulines) et leur dosage par néphélémétrie. Cependant, dans certains cas, l albumine peut être sous-estimée jusqu à 15 g/l, en cas d hypergammaglobulinémie.

17 Corrélation α1-globuline

18 Corrélation α2-globulines

19 Corrélation β-globulines

20 Corrélation γ-globulines

21 Immunofixation

22 Immunotypisation

23 IgM lambda

24 Sérum normal

34 Autres applications Electrophorèse capillaire Urines (nécessitent un prétraitement: dialyse, concentration dans la plupart des cas) CDT (transferrine désialylée) Hémoglobines (sans l HbA1c, malheureusement). Electrophorèse sur gel Iso-LDH Iso-CK Protéines urinaires (SDS) Lipoprotéines Autres applications (autres enzymes, IgE, IgD, etc.)

35 Passage de l électrophorèse sur gel à l électrophorèse capillaire, que conclure? Avantages Précision Rapidité Automatisation (les variations dues aux opérateurs sont minimisées) Stockage des résultats Traçabilité Facilité de recherche des cas Possibilité d aide à l interprétation (à utiliser avec prudence) Inconvénients Interférences (médicaments, produits de contraste, etc.), Immunotypage parfois difficile à interpréter, Il faut donc garder la possibilité d effectuer vérification par une immunofixation sur gel, l œil d un observateur expérimenté étant un «détecteur» très sensible.

36 Merci de votre attention! Avez-vous des questions?

Documents pareils

ANTICORPS POLYCLONAUX ANTI IMMUNOGLOBULINES

ANTICORPS POLYCLONAUX ANTI IMMUNOGLOBULINES L OUTIL IDEAL POUR TOUTES LES DETECTIONS IMMUNOCHIMIQUES pour toutes les techniques immunodosages (EIA/ELISA) dot/ westernblot immunohistochimie immunocytochimie cytométrie en flux quel que soit le système