Electrophorèse des protéines sériques sur gels d agarose

Transcription

1 Electrophorèse des protéines sériques sur gels d agarose 23 Octobre 2013 Lionel BEY Département Diagnostic SEBIA

2 Principe d électrophorèse des protéines sur gel - Cathode Anode Point d application

3 Systèmes semi-automatiques Sebia Hydrasys 2 Hydrasys

4 HYDRASYS 2 Module de coloration Module de lecture Module d application et de migration Choix de programme (migration et coloration)

5 Electrophorèse des protéines sériques sur gel Les protéines sont séparées en 5 ou 6 fractions (en fonction de type de gel utilisé). Après la coloration, les pistes présentent des bandes, dont l intensité correspond à la concentration protéique dans les fractions Pour déterminer l intensité des bandes il est nécessaire d utiliser un système de lecture: un densitomètre/un scanner (Hyrys 2, scanner à plat couplé au logiciel Phoresis, Hydrasys 2 scan, Gelscan).

6 Fractions des protéines sériques Albumine : Orosomucoïde, 1 Antitrypsine : Haptoglobine, Macroglobuline, Lipoprotéine, Céruloplasmine : Transferrine, Hémopexine, C3 Complément, Lipoprotéine : Immunoglobulines

7 Albumine Albumine Orosomucoïde 1 Antitrypsine 1 Antichymotrypsine Transferrine Hémopexine Lipoprotéine C 3 Complément Lipoprotéine Haptoglobine Céruloplasmine Gc globuline 2 Macroglobuline Orosomucoïde 1 Antitrypsine 1 Antichymotrypsine Transferrine Hémopexine Lipoprotéine Lipoprotéine Haptoglobine Céruloplasmine Gc globuline 2 Macroglobuline C 3 Complément Globulines G-A-M-D-E Globulines G-A-M-D-E Positions des différentes fractions sur les gels Hydragel 7 Protéine, Hydragel 15/30 Protéine et Hydragel 54 Protéine Positions des différentes fractions sur les gels Hydragel 7 β1-β2, Hydragel 15/30 β1-β2 et Hydragel 54 β1-β2

8 Comment visualiser et quantifier les protéines? Une fois les protéines révélées, le gel peut être analysé: À l œil nu - pour les anomalies qualitatives comme la présence de bandes additionnelles En utilisant des instruments de lecture (densitomètre, scanners) pour quantifier les fractions et détecter les anomalies quantitatives (ces instruments mesurent l absorbance/intensité de la coloration pour chacune des fractions)

9 Lecture de gels colorés avec HYDRASYS 2 SCAN pour quantifier l intensité de chaque bande du profil et obtenir les courbes ELP

10 Présentation des résultats Alb 1 2

11 Valeurs de référence pour Hydrasys HYDRAGEL 1 2 Sans standardisation* Avec standardisation* FRACTIONS HYRYS- PHORESIS HYRYS- PHORESIS Albumine % % Alpha % % Alpha % % Beta % % Beta % % gamma % % HYDRAGEL Protéine Sans standardisation* Avec standardisation* FRACTIONS HYRYS- PHORESIS HYRYS- PHORESIS Albumine % % Alpha % % Alpha % % Beta % % gamma % % *: Avec ou sans strandardisation avec les techniques Capillaire/Néphélométrique

12 Quantification du pic monoclonal La quantification du pic monoclonal est nécessaire pour: La classification d une gammapathie (MGUS, myélome indolent ou myélome symptomatique) L évaluation du stade du myélome symptomatique (stage I, II and III) Pour suivre l évolution d une gammapathie maligne ou d une gammapathie asymptomatique vers une gammapathie maligne Pour évaluer la réponse au traitement

13 Quantification du pic monoclonal La quantification par néphélométrie ou turbidimétrie: * La mesure inclut la concentration de la classe entière des Igs (monoclonale et polyclonales) inutilisable si la concentration de la protéine monoclonale est faible par rapport au fond polyclonal * Surestimation possible dans le cas des protéines monoclonales de forte concentration La quantification du pic sur la courbe d électrophorèse des protéines: * Recommandé par les experts * Quantification plus précise que la quantification par immunochimie * Requiert: une mesure précise de la concentration totale des protéines sériques: une mesure précise du pic

14 Quantification du pic monoclonal Patient 1 Quantification de l Ig monoclonale

15 Quantification du pic monoclonal sur Phoresis Mode du sommet à la base Mode de vallée à vallée Impératif: toujours utiliser le même mode pour le suivi des patients

16 Interprétations des résultats

17 Sérum normal N Aspect diffus et absence de bande en gamma & Aucune bande additionnelle en bêta et alpha 2 ou intensité plus importante de ces bandes de manière isolée Alb 1 2

18 Dépistage de pathologies multiples TP, g/dl Alb α-1 α-2 β1 β2 β- bridge Inflammation aigüe Inflammation chronique Hypergammaglobulinémie Maladie hépatique/cirrhose + Syndrome néphrotique Perte de protéines/malnutrition Réactions autoimmunes Déficit en Alpha-1-antitrypsine Hypogammaglobulinémie Anémie hémolytique protéines totales, Albumine, zones alpha 1 & 2, zone bêta, zone gamma (gammaglobulines )

19 Syndrome inflammatoire (inflammation aiguë) ALB N P A1AT ORO HPT Alb 1 2 Immunofixation n est pas nécessaire

20 Syndrome néphrotique N P Alb 1 2 Si le taux de protéines totales est diminuée également, une immunofixation n est pas nécessaire Si par contre le taux de protéines totales est normal, une immunofixation est recommandée

21 Profil cirrhotique (bloc bêta-gamma) N P Augmentation polyclonale des Ig A et Ig G Alb 1 2 Immunofixation n est pas nécessaire. Consulter le bilan hépatique du patient

22 Gammapathie Recherche des immunoglobulines monoclonales dans le sérum quand une gammapathie est suspectée: *Myélome, *Waldenström, * Leucémie lymphoïde chronique, lymphome Une protéine monoclonale migre en technique d électrophorèse comme une bande homogène est étroite. Elles se présentent généralement sous la présence une bande supplémentaire au niveau des zones gamma ou bêta mais également de la zone α2. Dans d autres cas, elles peuvent générer une augmentation d intensité de la bande normale observée en bêta ou alpha 2 de manière isolée. Si une telle bande est observée, des tests complémentaires doivent être réalisés pour caractériser cette immunoglobuline monoclonale

23 Myélome multiple et immunoglobuline monoclonale Plasmocyte Immunoglobuline Plasmocytes normaux Immunoglobulines normales = immunoglobulines polyclonales Protéinogramme normal Plasmocytes malins (Myélome) Immunoglobulines normales Immunoglobuline monoclonale Protéinogramme montrant un pic monoclonal

24 Faible immunoglobuline monoclonale en zone gamma N P Alb 1 2 La limite de détection d une Ig monoclonale est 0,25 à 0,5 g/l sur SEBIA hydragel proteine

25 Albumine Bisalbuminémie (double bande de l albumine), présence d une bande élargie ou d un épaulement sur l albumine : Bisalbuminémie congénitale (héréditaire) Bisalbuminémie transitoire (due à une interaction des molécules de médicament avec l albumine) Bisalbuminémie due à une pancréatite aiguë: (dégradation de l albumine par des enzymes pancréatiques libérés dans le sérum)

26 Bisalbuminémie

27 Bisalbuminémie N P Alb 1 2 Immunofixation n est pas nécessaire

28 Phénotype Hétérozygote d A1AT N P Mutation du gène alpha 1 anti-trypsine Alb 1 2 Immunofixation n est pas nécessaire

29 Alpha-2 globulines Double bande dans le cas de : Echantillon hémolysé (complexes haptoglobine-hémoglobine) Phénotypes particuliers d haptoglobine Mobilité atypique des alpha-lipoprotéines Présence d une immunoglobuline monoclonale de mobilité anodique Augmentation dans le cas de : Syndrome inflammatoire Syndrome néphrotique Présence d un composant monoclonal de mobilité anodique (chaînes légères libres)

30 Echantillon hémolysé N P Complexe Haptoglobine-Hémoglobine Alb 1 2 Nouveau prélèvement nécessaire

31 Immunoglobuline monoclonale en alpha-2 N P Alb 1 2 Elévation isolée hors contexte inflammatoire Immunofixation est nécessaire

32 Bêta-globulines Double bande dans le cas de : Echantillon vieilli ou un sérum avec concentration élevée de cholestérol (LDL a une mobilité modifiée, ce qui provoque le dédoublement de la fraction bêta) Présence d un composant monoclonal Augmentation dans le cas de : Obstruction biliaire Syndrome néphrotique Cirrhose Anémie ferriprive Présence d un composant monoclonal Hyperlipoproteinémie Hémolyse important (présence d hémoglobine libre)

33 Bêta lipoprotéines

34 Immunoglobuline monoclonale en bêta N P Alb 1 2 Elévation isolée hors anémie ferriprive Immunofixation est nécessaire

35 Hypogammaglobulinémie Diminution dans le cas de : Gamma-globulines Immunodéficience primaire ou secondaire (traitement immunosuppresseur, corticoïdes, chimio/radiotherapie ) Myélome à chaînes légères ou myélome non sécrétant Physiologique chez le nouveau-né Hypergammaglobulinémie Augmentation polyclonale des immunoglobulines en zone gamma - Inflammation - Cirrhose - Infections aiguës et chroniques

36 Gamma-globulines Bande(s) surnuméraire(s) : Immunoglobuline monoclonale Profil oligoclonal Présence du fibrinogène (échantillon de plasma)

37 Hypergammaglobulinémie N P Augmentation du fond polyclonal en gamma Alb 1 2 Immunofixation n est pas nécessaire

38 Immunoglobuline monoclonale importante en gamma N P Alb 1 2 Immunofixation est nécessaire

39 Faible immunoglobuline monoclonale en gamma N P Alb 1 2 Immunofixation est nécessaire

40 Gammapathie biclonale (deux pics monoclonaux) N P Alb 1 2 Immunofixation est nécessaire

41 Présence de fibrinogène (plasma ou un sérum d un patient sous anti-coagulants) Fibrinogène Fibrinogène Alb 1 2 Immunofixation est nécessaire ou traitement à l éthanol 10%

42 Hypogammaglobulinémie sans autre anomalie monoclonale visible N P Pas d anomalie visible en alpha 2 ou bêta Alb 1 2 Si les causes de cette hypogammaglobulinémie ne sont pas connues, faire la recherche de protéine de Bence Jones dans les urines

43 Profil oligoclonal en gamma Le Profil oligoclonal : Présence de plusieures bandes étroites homogènes (d habitude de faible intensité) en gamma. Il est dû à l augmentation de plusieurs sous classes d immunoglobulines, donnant un aspect de bandes monoclonales multiples appelé profil oligoclonal ou bandes oligoclonales. Ce profil est observé au cours des : - maladies auto-immunes (arthrite rhumatoïde, syndrome de Gougerot- Sjögren, lupus érythémateux) - maladies infectieuses (virales, bactériennes et parasitaires) - H.I.V. - hépatites virales - infection à cytomégalovirus - réactions auto-immunes chez les transplantés et les patients sous traitement immunosuppresseur.

44 Profil oligoclonal en gamma N P Alb 1 2 Immunofixation est nécessaire

45 Le tracé électrophorétique doit être analysé en termes des anomalies qualitatives et/ou quantitatives : * Zones augmentées * Zones diminuées En résumé * Présence des bandes surnuméraires, bandes trop larges / d un aspect inhabituel L analyse qualitative est réalisée visuellement, en inspectant attentivement le gel (la vision humaine est plus résolutive qu un système de lecture il est plus facile de trouver une discrète condensation en gamma ou un aspect un peu inhabituel d une bande en bêta à l œil qu en regardant la courbe densitométrique) L analyse quantitative (augmentation ou diminution des zones) est réalisée à partir de la courbe densitométrique

46 En résumé Informations à considérer pour interprétation: * Vue globale du tracé électrophorétique * Couleur et aspect du sérum * Concentration des protides totaux * Age du patient. Un patient de plus de 45 ans a plus de probabilité d avoir une bande monoclonale qu un patient plus jeune * Informations cliniques, si disponibles: douleurs osseuses, perte du poids, anémie, VS augmentée, hypercalcémie.

47 Les tracés ne nécessitant pas d immunofixation Profil normal Profil inflammatoire Profil néphrotique Dédoublement des alpha-1 Dédoublement des alpha-2 Dédoublement et/ou augmentation des alpha-2 dans le cadre d hémolyse Bisalbuminémie Bloc bêta-gamma Une bande surnuméraire en bêta-1 si elle a un aspect typique de bêta-lipoprotéines (bande très focalisée, en «moustache») Patient connu (si la position de la migration de la bande ne change pas et s il n y a pas d apparitions de bandes supplémentaires) Les tracés nécessitant une analyse complémentaire par immunofixation Bande ou condensation en zone gamma Aspect inhabituel des fractions bêta (bêta-1 ou bêta-2): dédoublement; bande plus large que d habitude; bande «floue» Augmentation isolée des bêta-1 (hors contexte d anémie ferriprive) Augmentation isolée des bêta-2 (bêta2 > bêta1) Hypogamma avec/sans bande visible Patient avec une antériorité de pic monoclonal + absence d anomalie sur le tracé du jour Protéine de Bence Jones dans les urines + pas d évidence de protéine monoclonale dans le sérum Augmentation isolée des alpha-2 (hors contexte inflammatoire et néphrotique), surtout si associée à une hypogamma

48 Causes d erreurs

49 Echantillons en surcharge (la chambre humide n a pas été utilisée) ou Echantillons vieillis (conservés plus d une semaine à 4 C) Bêta-lipoprotéines

50 Position 1: la membrane a été endommagée Ne pas toucher la membrane des puits au moment de dépôt des échantillons sur l applicateur, pour ne pas la trouer.

51 Goutte de sérum est tombé sur gel Placer l applicateur sur le chariot avec précaution, éviter les mouvements brusques

52 Mauvaise reconstitution du colorant 15 ml du diluant au lieu de 60 ml Diluant oublié

53 Reconstitution et utilisation du colorant

54 Solution de lavage a été utilisée au lieu du décolorant

55 Gels gelés Respecter les conditions de stockage

56 Migrations courtes: déshydratation des mèches / du gel ou problème de réglage du chariot Vérifier systématiquement l absence d un excès de liquide dans les sachets des mèches et du gel; Respecter les conditions du stockage (à plat, à l abri de toute source de chaleur); Si le problème persiste contacter le service SAV

57 Encore quelques cas pour s entraîner

58 Profil normal Hydragel Protein(e) Alb 1 2 Immunofixation n est pas nécessaire

59 Bande monoclonale en gamma Hydragel Protein(e) Alb 1 2 IF est nécessaire

60 Inflammation chronique; Hypergammaglobuminémie Hydragel β1- β2 Alb Immunofixation n est pas nécessaire

61 Hypergammaglobulinémie avec discrètes bandes sous-jacentes Hydragel β1- β2 Alb Si les discrètes bandes sont visibles sur le fond polyclonal, une IF pourra être réalisée. Une fois les anomalies caractérisées, refaire l électrophorèse à distance dans 3 à 6 mois pour voir la persistance en l absence d hypergammaglobulinémie

62 1. Inflammation chronique 2. Profil oligoclonal/gammapathie biclonale/ immunoglobuline monoclonale polymérisée? - IF est nécessaire afin de distinguer la situation si contexte de gammapathie possible - Alternative: refaire l électrophorèse à distance (3 à 6 mois) de l épisode inflammatoire Hydragel β1- β2 Alb

63 Bloc bêta2-gamma + discrète déformation en gamma Hydragel β1- β2 Alb Si une discrète bande focalisée est visible, réaliser une IF. - Dans d autres cas, vérifier le bilan hépatique et refaire l électrophorèse à distance, dans 3 à 6 mois pour suivi de l évolution

64 1. Profil inflammatoire +hypogammaglobulinémie 2. Discrète bande monoclonale en gamma plus visible sur le gel directement Hydragel Protein(e) Alb 1 2 IF est nécessaire

65 1. Hypogammaglobulinémie 2. Recherche une éventuelle anomalie sur les autres fractions: on note une élévation quantitative dans les fractions bêta et alpha 2 Hydragel Protein(e) Alb 1 2 IF est nécessaire pour investiger une éventuelle anomalie monoclonale en bêta ou alpha 2. En cas d absence d anomalie monoclonale, voir un possible contexte d élévation des lipoprotéines sur ces fractions

66 Augmentation isolée des alpha-2 + élargissement de la fraction bêta 1 Hydragel β1- β2 Alb La forme particulière en bêta 1 indique la présence de bêta-lipoprotéines. Pour statuer sur les alpha 2, un dosage des alpha-lipoprotéines est à recommander. Si les alpha-lipoprotéines ne sont pas en cause, réaliser une immunofixation

67 1. Bande surnuméraire en bêta1 avec un aspect typique des lipoprotéines (très focalisée, en «moustache» Hydragel β1- β2 Alb Echantillon vieilli / lipémique? Immunofixation n est pas nécessaire

68 1. Protéine monoclonale en bêta 2. Hypogammaglobulinémie et une discrète bande monoclonale en gamma Hydragel Protein(e) Alb 1 2 IF est nécessaire

69 Bande monoclonale en bêta-2 dans un contexte hypogammaglobulinémie Hydragel β1- β2 Alb 1 2 IF est nécessaire

70 1. Profil inflammatoire 2. Bande monoclonale supplémentaire en bêta-2 associée à une hypogammaglobulinémie Hydragel β1- β2 Alb 1 2 IF est nécessaire

71 Merci de votre attention!