Formation Biologie Moléculaire. Dakar Septembre 2006

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1 Formation Biologie Moléculaire Dakar Septembre 2006

2 La naissance de la biologie moléculaire Les lois de l héréditl dité (Mendel, 1866) La théorie chromosomique de l héréditl dité (Morgan, 1910) Le codage des protéines par les gènes g (Garrod, 1902) L ADN, support biochimique de l information l génétique (Griffith, 1928; Avery 1944, Chargaff,, 1950) La structure de l ADN l (Watson & Crick, 1953)

3 La structure des acides nucléiques Les nucléotides Bases : purines A et G pyrimidine C, T et U Ose (sucre) : ribose et désoxyribosed Acide phosphorique

4 La structure des acides nucléiques Nomenclature des nucléotides : Purines (A, G) : «ine», «ylique» Pyrimidines (C, T, U) : «idine, «idylique»

5 La structure des acides nucléiques Liaison entre les nucléotides : liaison phosphodiester Sens de lecture d une d chaîne de nucléotides : 5 3

6 La structure des acides nucléiques L ADN : caractéristiques ristiques Bases : A, T, C, et G Ose : désoxyribosed Double chaîne : antiparallèle le, complémentaire mentaire, hélicoïdale

7 La structure des acides nucléiques L ADN : propriétés s physico-chimiques chimiques Dénaturation Absorption dans les UV Enroulement et compaction

8 La structure des acides nucléiques Les ARN : caractéristiques ristiques généralesg Bases : A, U, C, et G Ose : ribose Simple chaîne Les principaux types d ARNd ARNr (ribosomique) ARNt (de transfert) ARNm (messager)

9 La réplication r de l ADNl Caractéristiques ristiques générales g : Semi-conservative Bidirectionnelle Complémentaire mentaire et dans le sens 5 3 Discontinue Éléments nécessaires n : ADN matrice Amorces ARN Désoxyribonucléotidesotides : datp, dttp, dctp et dgtp Nombreuses enzymes Ions Mg 2+

10 La réplication r de l ADNl Les différentes étapes : Déroulement de la double hélice h par l ADN l hélicase Stabilisation sous forme simple brin par les protéines SSB Synthèse d amorces d ARN par la primase Hybridation des amorces sur l ADNl Synthèse du brin complémentaire mentaire par l ADN l polymérase Destruction des amorces ARN par la RNase H Réparation des lacunes par l ADN l polymérase Ligation des fragments d ADN d synthétis tisés s par l ADN l ligase

11 La réplication r de l ADNl Discontinuité de la réplication r entre les deux brins d ADN d : Brin avancé / brin retardé Fragments d Okazakid Réparation des erreurs de réplicationr

12 La Transcription de l ADN l en ARNm Caractéristiques ristiques générales g : dans le sens Anti-parall parallèlele complémentaire mentaire Éléments nécessaires n : ADN matrice Ribonucléotides otides : ATP, UTP, CTP et GTP ARN polymérase Ions Mg2+

13 La Transcription de l ADN l en ARNm L unité de transcription

14 La Transcription de l ADN l en ARNm Les différentes étapes : Initiation Élongation Terminaison pré-arnm

15 La Transcription de l ADN l en ARNm La maturation Addition de la coiffe en 5 5 Addition de la queue polya en 3 3 Élimination des introns ARNm

16 La Traduction de l ARNml en protéine Caractéristiques ristiques générales g : Déplacement des ribosomes sur l ARNml dans le sens 5 3 Synthèse protéique de l extrl extrémité N-terminale à l extrémité C-terminale Polysomes :

17 La Traduction de l ARNml en protéine Éléments nécessaires n : ARNm Ribosomes ARNt Acides aminés Enzyme aminoacyl-arnt synthase Les différentes étapes :

18

19 La Traduction de l ARNml en protéine Le code génétiqueg Code de 3 lettres, dégénéréd

20 La Traduction de l ARNml en protéine Le code génétiqueg Universel Cadre de lecture Si on considère par exemple la séquence s suivante d'un ARNm : ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG... Les trois cadres de lecture possibles (en rouge) sont : ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG... A CGA CGA CGA CGA CGA CGA CGA CGA... AC GAC GAC GAC GAC GAC GAC GAC GAC...

21 Le polymorphisme de l ADNl Remaniements chromosomiques Translocations Inversions Fusions Délétions insertions Mutations ponctuelles Substitutions : transitions et transversions Délétions insertions Séquences répétées r en tandem

22 Le polymorphisme de l ADNl Mécanismes générant g du polymorphisme Erreurs de réparationr Recombinaisons inégales Conversion géniqueg Insertions de séquences s mobiles Glissement intra-chromatidien

23 Les outils et techniques de la biologie moléculaire

24 Enzymes de restriction Outils : les enzymes Endonucléases Site de restriction (palindrome) Coupure à bouts francs ou cohésifs Enzyme de digestion autres que les enzymes de restriction Exonucléases Endonucléases Polymérases Ligases

25 Outils : les amorces et les sondes Courtes séquences s d ADN d (15 à 30 nucléotides) Complémentaires mentaires de certaines régions r d ADN Utilisation : Amorces marquées ou non : PCR Sondes marquées : identification de séquences d ADNd

26 Outils : les vecteurs et les cellules hôtes Vecteur ADN circulaire Autoréplication dans les cellules hôtes Insertion d ADN d exogène Gènes de sélections Cellules hôtes Microorganismes Compétentes

27 Techniques : extraction-purification d ADN Isolement de l ADN l (qualité et quantité) 2 étapes : Extraction (digestion des tissus et lyse des cellules) Purification (séparation de l ADN l des autres constituants cellulaires) Plusieurs techniques : Phénol/chloroforme Kit Qiagen Kit Puregene

28 Techniques : extraction-purification d ADN Comparatif des différentes méthodes m de purification 1 : la moins bonne, 3 : la meilleure

29 Techniques : migration sur gel et visualisation de l ADNl Migration électrophorétiquetique Séparation des fragments d ADN d en fonction de leur taille Résolution des gels : agarose et acrylamide Visualisation Détermination de la taille des fragments d ADNd Évaluation de la quantité d ADN Évaluation de la qualité d ADN

30 Techniques : PCR Réaction de polymérisation en chaîne Basée e sur le mécanisme m de réplication r de l ADNl Polymérase thermostable Nécessité de connaître les régions r flanquantes Répétition de cycles : amplification exponentielle

31 Techniques : PCR 1. Dénaturation de l ADNl 2. Hybridation des amorces sur l ADNl 3. Elongation des brins complémentaires mentaires

32 Techniques : PCR Les principaux types de PCR Hot Start PCR Touch Down PCR Touch Up PCR Optimisation Optimisation Mg 2+ Optimisation température d hybridation d des amorces Optimisation du nombre de cycle Ajout d adjuvantsd

33 Règles d optimisationd Si l'amplification donne trop de bandes : diminuez la concentration en Mg 2+ ; diminuez légèrement le nombre de cycle; augmentez la température d'hybridation des amorces (max 62 C); faites une Touch Down PCR. Si l'amplification est trop faible : augmentez la concentration en Mg 2+ ; augmentez légèrement le nombre de cycle; diminuez la température d'hybridation des amorces (min 45 C); faites une Touch Up PCR. Techniques : PCR

34 Techniques : PCR-RFLP RFLP Polymorphisme de longueur de fragments de restriction sur une PCR Polymorphisme de restriction Région identifiée Marqueur co-dominant Principe : Digestion de produits PCR par une enzyme de restriction Migration sur gel d agarosed Révélation des bandes

35 Techniques : PCR-RFLP RFLP

36 Principe : Techniques : séquens quençage Amplification par PCR particulière re : ADN matrice = fragment amplifié par PCR Une seule amorce par réactionr Nucléotides = dntp + ddntp fluorescents Migration sur gel d acrylamided Visualisation à l aide d un d laser

37 Techniques : séquens quençage

38 Techniques : génotypage microsatellites Répétitions en tandem de courts motifs polymorphisme de longueur Régions identifiées es Marqueur co-dominant Principe : Amplification par PCR Migration sur gel d acrylamided Visualisation des fragments amplifiés

39 Techniques : génotypage microsatellites

40 Techniques : génotypage AFLP Polymorphisme de longueur de fragments amplifiés polymorphisme de restriction Génome total, régions r inconnues Marqueur dominant Principe : Digestion de l ADN l génomique g par deux enzymes de restriction Ligation d adaptateurs Amplifications par PCR Migration sur gel d acrylamided Visualisation des fragments amplifiés

41 Techniques : génotypage AFLP

42 Techniques : génotypage AFLP

43 Technique : génotypage SSCP Polymorphisme de conformation simple brin La conformation 3D de l ADN l dépend d de sa composition en bases Détection de mutations ponctuelles Marqueur co-dominant Principe : Amplification par PCR d une d région r d ADN d contenant une ou plusieurs mutations ponctuelles Migration sur gel d acrylamided Visualisation des fragments amplifiés

44 Techniques : génotypage SSCP

45 Création d une d banque d ADN d génomique : Digestion du vecteur Digestion de l ADN l génomique Ligation des fragments dans les vecteurs Transformation des bactéries Isolement des différents clones cellulaires Sélection des clones ayant incorporés s un fragment d ADN d génomique Techniques : clonage

46 Techniques : clonage Recherche des fragments d intd intérêt : Transfert sur membrane Éclatement des bactéries Fixation de l ADNl Hybridation d une d sonde marquée Révélation Récupération des bactéries et mise en culture Séquençage