Laurent DUHAU Sanofi R&D

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1 Laurent DUHAU Sanofi R&D 2 avril 2014

2 Immunoconjugués Une nouvelle classe de médicaments en pleine expansion dans le domaine de l oncologie Etudes cliniques en cours en 2011/2013

3 Immunoconjugué: structure schématique Chaine lourde Chaine légère cytotox cytotox cytotox cytotox Anticorps monoclonal Molécule de Liaison* Cytotoxique * Principalement via résidus lysine ou cystéines

4 Recherche d une action ciblée Liaison à l antigène cible à la surface de la cellule Internalisation par endocytose endosome MORT CELLULAIRE Action sur ADN ou microtubule Cellule cancéreuse Libération du cytotoxique-mol de liaison : Antigène cible Degradation de l Ac dans le lysosome

5 Complexité à développer et à produire Chimie Cytotoxique Molécule de liaison Principe actif biologique Médicament injectable Culture cellulaire Anticorps Cumul de contraintes ( sécurité, microbiologiques, changement d échelles) dans un environnement règlementé

6 Complexité structurale Hétérogénéité typique d un anticorps Ordre de grandeur du nombre de «variants»: 2x2 3 x2 2 x2 2 x5x5x2= soit ~10 8 Immunoconjugué: hétérogénéité renforcée par plus de 25 sites de conjugaison différents (lysines): Défi analytique pour caractériser ces molécules

7 Complexité à caractériser Analyse Ac Profil de glycosylation Impuretés du procédé (HCP, Prot A, ADN, ) Affinité Fonctions effectrices Carte peptidique Dosage UV Pureté SEC, CE-SDS SDS Page, variants de charge Particules subvisibles Contamination micro Endotoxines.. Dosage chromato Profil d impuretés Analyse cytotoxique & agent de liaison Analyse Immunoconjugué Cytotoxiques libres Ratio cytotox/ac Profil de conjugaison Sites de conjugaison Dosage biologique cytotoxicité

8 mv Minutes AU PDA - 220nm 10/22/ :04:37 PM3016ET Minutes AU Absorbance Units Immunoconjugué: méthodes analytiques Qualité microbiologique Activité Contamination microbienne et «Dosages biologiques & affinité» endotoxines Structure Primaire (Spectrométrie de masse) Impuretés liées au procédé de conjugaison (RP-HPLC, HIC, GC) Structures IIaire et IIIaires (DSC, FTIR, CD & fluorescence) Agrégation (SEC, AUC, A4F, DLS, RMM, FCM) Pureté & hétérogénéité (SDS-Page, icief, CE, WCX, ) Wavenumber cm

9 Stratégie d analyse par spectrométrie de masse IgG1 (150 kda) Niveau 1 : Ac intègre -/+ PNGAseF C H 2 C H 3 C H 2 C H 3 Niveau 2 : Chaines H et L après réduction /alkylation Séparation par chromatographie 2 x L (25 kda) H (50 kda) Niveau 3 : carte peptidique après digestion enzymatique Trypsin, Lys-C Glu-C,

10 % [Mab + 1 cytotox [Mab + 5 cytotox [Mab + 6 cytotox] [Mab + 7 cytotox] [Mab + 2 cytototox [Mab + 3 cytotox [Mab + 4 cytotox] Analyse par spectrométrie de masse d un Immunoconjugué (niveau 1) Echantillon déglycosylé analysé par chromatographie d exclusion couplée à la spectrométrie de masse (UPLC/SEC / ESI ToF MS) Mesure de l ensemble des masses moléculaires des espèces en présence: accès au profil de conjugaison SAR3419 lotbx11 integre DG E1 315 (5.775) Sb (30,60.00 ); M1 [Ev-89743,It7] (Gs,1.000,2513:4000,1.00,L33,R33); Sb (10,20.00 ); Cm (280:373) Ratio cytotox/anticorps -Profil de conjugaison -% d anticorps nu 1: TOF MS ES Ac Nu Ac Conjugué Spectres de masse ESI+ TOF MS déconvolué pour Ac Nu et pour Ac conjugué Hétérogénéité liées aux espèces cytotox conjuguées et aux lys C term mass

11 Analyse par spectrométrie de masse d un Immunoconjugué (niveau 3) MS/MS permet d identifier les Lysines impliquées dans la conjugaison % de modification Déamidation en N134 de la LC 2.0 Oxydation en M255 de la HC 1.8 Déamidation en N289 de la HC 1.6 Déamidation en N de la HC 8.4 Evaluation des % de modifications post traductionnelles (deamidation, oxidation,..)

12 Spectrométrie de masse: technique essentielle lors des études de comparabilité Comparaison des lysines conjuguées avant/après le changement de procédé Light Chain XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXKXXXXXX XXXXXXXXXX XXKXXXXXXX XXXXXXXXXX XKXXXKXXXX XXXXXXXXXX XXXXXKXXXX XXXXXXXXXK XXXXKXKXXX XXXXXXXXXX XXXKXXXXXX X Heavy Chain XXXXXXXXXX XXKXXXXXXX XXKXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXKX XXXKXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXKXXXX XXXXXXXXXK XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXKKXXX KXXXKXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXKX KXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXKXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXK XXKXKXXXKX XXXXXXKXXX KXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXKXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXK Avant le changement Light Chain XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXKXXXXXX XXXXXXXXXX XXKXXXXXXX XXXXXXXXXX XKXXXKXXXX XXXXXXXXXX XXXXXKXXXX XXXXXXXXXK XXXXKXKXXX XXXXXXXXXX XXXKXXXXXX X Heavy Chain XXXXXXXXXX XXKXXXXXXX XXKXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXKX XXXKXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXKXXXX XXXXXXXXXK XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXKKXXX KXXXKXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXKX KXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXKXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXK XXKXKXXXKX XXXXXXKXXX KXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXKXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXK Après le changement Mêmes Lysines sont conjuguées 8 sur LC and 19 sur HC et 54 sont modifiées (Total 94)

13 Méthodes utilisées pour évaluer l agrégation Agrégats Irréversibles / réversibles / covalents particules visibles et subvisibles IgG ~5 nm Dimer 10-mer µm mm nm Soluble Insoluble Méthodes de contrôle Méthodes orthogonales pour la caractérisation Size Exclusion Chromatography DLS (Dynamic Light Scattering) A4F (Asymmetrical flow field flow fractionation) SV-AUC Velocity sedimentation Particle counter FCM (Flow Cell Microscopy) Une seule méthode ne suffit pas pour évaluer le taux d agrégation des protéines Indispensable d utiliser des méthodes orthogonales Focalisation spécifique sur les particules visibles/sub-visibles (Immunogenicité?) RMM Resonant Mass Measurement

14 Agrégation: méthodes orthogonales SV-AUC: Ultra Centrifugation Analytique Chromatographie d exclusion Coeff sédimendation: distribution Bonne corrélation entre les 2 methodes justifiant l utilisation de la chomatographie d exclusion en routine

15 Conclusion Les Immunoconjugués sont des médicaments prometteurs extrêmement complexes à produire et à analyser L analyse des immunoconjugués nécessite de disposer de nombreuses techniques analytiques et des expertises correspondantes La spectrométrie de masse à Haute Résolution est une technologie essentielle pour évaluer les attributs qualité critiques des Immunoconjugués (profil de conjugaison, sites) De part l hydrophobicité des cytotoxiques, la problématique d agrégation doit être suivie avec attention La caractérisation analytique approfondie est stratégique pour permettre le développement de ces molécules biologiques

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