CENTRE D'ETUDES NUCLEAIRES DE SACLAY CEAXONF Service de Documentation F9I191 GIF SUR YVETTE CEDEX N3

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1 f {kséo (\ S J COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE CENTRE D'ETUDES NUCLEAIRES DE SACLAY CEAXONF Service de Documentation F9I191 GIF SUR YVETTE CEDEX N3 Purification et fragmentation d'anticorps monoclonaux utilisés dans le domaine du diagnostic. Exemple d'anticorps anti-ace. Purification and fragmentation of monoclonal antibodies for the cancer diagnostic field. Example of anti-cea antibodies. C. VIDAUD - P. SEGUIN -E.J.P. JOLU Compagnie ORIS Industrie BP BAGNOLS /CEZECEDEX Communication présentée à : Hybride»»» 85 fori* ^France) Nov 1985

2 Purification et fragmentation d'anticorps monoclonaux utilisés dans le domaine du diagnostic. Exemple d'anticorps anti-ace. Purification and fragmentation of monoclonal antibodies for the cancer diagnostic field. Example of anti-cea antibodies. C. VIDAUD - P. SEGUIN -E.J.P. JOLI/ Compagnie ORIS Industrie BP BAGNOLS /CEZE CEDEX Pour permettre le développement des méthodes de détection iq_yivo et invitro de l'antigène carcinoembryonnaire (ACE) nous avons sélectionné quatre anticorps monoclonaux anti-ace. Nous présentons les techniques de production, de purification, de fragmentation et de contrôle de qualité qui nous permettent d'assurer la fourniture de ces réactifs au niveau de 50g/an. For the development of the methods of in vivo and in vitro detection of carcinoembyonic antigen (CEA), we have selected four anti- CEA monoclonal antibodies. We present here methods for the production, purification, fragmentation and quality control which allow us to produce up to 50g per year of reagents.

3 Purification et fragmentation d'anticorps monoclonaux utilisés dans le domaine du diagnostic. Exemple d'anticorps anti-ace. Purification and fragmentation of monoclonal antibodies for the cancer diagnostic field. Example of anti-cea antibodies. C.VIDAUD - P. SEGUIN - E.J.P JOLU - Compagnie ORIS Industrie DP BAGNOLS SUR CEZE CEDEX Parmi les marqueurs tumoraux utilisés en biologie clinique, l'antigène carcinoembryonnairea une pi ace prépondérante. Quatre anticorps anti-ace ou leurs fragments ont été sélectionnés selon des critères d'affinité, de spécificité, mais aussi pour leurs propriétés biologiques. Ils entrent dans la composition de trousses qui permettent de doser l'ace circulant (ELSA- CEA), de visualiser sa présence dans les coupes histologiques (HISTOCIS) et de localiser des tumeurs in_yivo (IMACIS). Nous décrivons ici des techniques de production, de purification,et defragmentation de l'un des anticorps (G 15) utilisé sous forme IgG sur une phase solide pour la fixation de l'ace dans le dosage in_vitrg et sous forme de fragment F(ab') 2 radiomarqué pour la détection des tumeurs en immuno-imagerie.ces méthodes nous permettent d'assurer une production de l'ordre de 50g/an. Among tumoral markers used 1n clinical biology the carclnoembryonic antigen Is the leader product. Four anti-cea antibodies or their fragments have been selected because of their sped fid ty,aff1n1ty and biological properties.they are used in kits for CEA assays in blood (ELSA-CEA),for CEA detection in tissue slides (HISTOCIS) and to virualize tumors (IMACIS). We present here methods for production,purification and fragmentation of an anfibody(g 15) used asigg on a solid phase to bind the CEA In the 1_n_vUro assay and as F (ab') 2 fragment for the Itijrlvo detection of tumors. These methods allow to meet our requirements In production of 50g/year.

4 INTRODUCTION Parmi les marqueurs tumoraux utilisés en biologie clinique, l'antigène carcinoembryonnaire (ACE), a une place prépondérante. Des fusions réalisées^ dans nos laboratoires ont permis d'obtenir plusieurs anticorps monoclonaux anti-ace, sélectionnés selon des critères d'affinité, de spécificité, et également selon leurs propriétés biologiques. Quatre d'entre eux entrent dans la composition de trousses qui permettent de doser l'ace circulant (ELSA-CEA), de visualiser sa présence dans des coupes histologiques (HISTOCIS), et de localiser les tumeurs (1MACIS). Nous décrivons ici des techniques de purification et de fragmentation de l'un de ' ces anticorps (G 15) utilisé sous forme d'igg sur une phase solide pour la fixation de l'ace dans le dosage immunoradiométrique et sous forme de fragments Ffab'^ ' radiomarqués pour la détection des tumeurs en immuno-imagerie. Cette double utilisation entraine une augmentation des niveaux de production. DISCUSSION Les techniques de purification actuellement utilisées nous ont permis d'assurer la production d'anticorps hautement purifiés, et devraient nous permettre de répondre à une exigence de 50 g/an. Des optimisations des méthodes de fragmentation sont en cours pour obtenir des cycles de 1 g de F(ab'L. Dans un exemple choisi (G15), il faut 2500 souris pour fournir le volume de liquide d'ascité nécessaire à cette production d'igg. Cette méthode exige une main d'oeuvre et une animalerie conséquentes. Mais elle suffisamment souple pour permettre la production de plusieurs anticorps à des niveaux très différents. Actuellement, nous produisons de cette façon les anticorps entrant dans la composition de trousses ELSA et ENZELSA de la Compagnie ORIS INDUSTRIE : AFP, TSH, PRL, HCG, LH, FSH. Cependant, i terme, nous envisageons de réaliser en fermenteur les production» les plus importantes.

5 FRAGMENTATION DE L'ANTICORPS METHODE : - Digestion pepsique à 1 %, ph «4,0 (4 à 6 h) à 37 C. - Elimination des Fc par gel filtration (ACA 34) et des IgG résiduelles par échange d'ions (A 50) (Fig.V). IgG TRAITEES : 350 mg par cycle RENDEMENT : 70 % par rapport aux IgG initiales PRODUCTION PAR CYCLE : 160 mg CONTROLE DE QUALITE : * FPLC - Gel filtration (TSK G3000) (Fig. VI) - Echange d'ions (Mono Q) (Fig.VII) * Immunoréactivité (Fig.VIH) La pureté du produit obtenu est supérieure ou égale à 95 %. PURIFICATION DE L'ANTICORPS METHODE : - Précipitation du liquide d'ascite par le sulfate d'amonium à 50 %, - Elution (socratique sur échangeur d'ions (Fig. I) VOLUME TRAITE RENDEMENT : Jusqu'à 700 ml : 80 % (6,5 mg d'anticorps purifié par ml d'ascite) PRODUCTION PAR CYCLE : Jusqu'à 4,5 g CONTROLE DE QUALITE : * FPLC - Gel filtration (TSK G3000) (Fig.II) - Echange d'ions (Mono Q) (Fig.IH) * Immunoréactivité (Fig.IV) La pureté du produit est supérieure à 95 %.

6 Fig. V Purification du fragment Ffab'L G15 Elution mir ACA 34 et A 50 8 ml

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8 I t h.'bo t\% IV Contrôle «'uwiianacmtié > CI» - DMMtam cfotamtm «t CI» - Trace*» ACE!» i I "* » » ' » ng.al -i tt/so rig. VIII CONTAI* tf'laiaiiaorttcuviu * TWb\ Cl» - Anticorps C I» fui Mr pham «olidf - CgaemtriMioa» M M M de Flab'l, CI» ACE aar«yé i I 12» SO rij.wl-1

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