FISH interphasique sur coupe en paraffine

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1 1 FISH interphasique sur coupe en paraffine Particularités techniques et De lecture 15/10/2015

2 technique 2

3 3 Protocole sur paraffine Différentes étapes Sur coupe de 3-5µm sur lames superfrost Déparaffinage Sous hotte 4 bain de xylène Solution de lavage a RT Réhydratation du tissu Étape de prétraitement dans bain de thiocyanate de sodium chaud Rompre les liaisons covalentes liées à la fixation BM ou micro onde 10 mn Refroidissement dans la solution de prétraitement Tampon de lavage Digestion enzymatique à la pepsine (temps de digestion)

4 4 Protocole sur paraffine Différentes étapes Digestion enzymatique à la pepsine (temps de digestion) Permet la pénétration de la sonde Pepsine fragile (4 C) RT ou 37 C sur plaque ou dans des bacs 3-10mn lavage Déshydratation Dénaturation hybridation Ex 85 C 5 mn 37 ou 45 C Lavages stringents Différents selon la marque de sonde 10mn a 65 C 2mn à 73 C

5 5 Protocole sur paraffine Différentes étapes Déshydratation Montage en Dapi + antifading

6 Lecture 6

7 7 La lecture Evaluer le matériel à analyser : HES avant lecture contenu en cellules tumorales, artéfact d écrasement,, nécrose, qualité de la coupe densité cellulaire Utilisation du Z Microscope pour lire les lames HES et/ou IHC à disposition Repérer la zone à analyser Contexte clinique

8 8

9 9 Facteurs influençant le résultat Épaisseur de la coupe, lames superfrost Temps d ischémie froide Qq minute (biopsie) <1H pièces opératoire Fixateur utilisé et qualité de la fixation Grande cause d échec 6-8H biopsies 24-48H pièces Temps de digestion à adapter Bouin Inclusion en paraffine <60 C

10 10 Facteurs influençant le résultat Délai depuis lequel la coupe est faite et sa conservation Nature du tissu Tissu adipeux - peau Foie Présence d éosine pour les petites biopsies Os et décalcification Concentration et durée maitrisée Favoriser l EDTA ou l acide formique % de cellules tumorales Lame HES +/-IHC Coupes contigues Localisation par l anapath Hétérogénéité tumorale Blocs épuisés

11 11 Taille du fragment Facteurs influençant le résultat Température d utilisation de la pepsine Fabriquant de la sonde Concentration des sondes Lavages à adapter

12 Cas non évaluables 12

13 Chevauchement, écrasement 13

14 Autofluorescence en cadre 14

15 Bruit de fond lié à l éosine 15

16 16 Estimation de la qualité de la technique Trop digéré Digestion insuffisante Possibilité de jouer sur le lavage aussi : temps, température et la stringence

17 17 Quelles anomalies Délétions Amplifications Anomalies de structure +/- équlibrées

18 18 Amplifications Deux mécanismes d amplification génique Double minute ou épisome HSR homogenous staining region

19 19 Amplifications Deux mécanismes d amplification génique HSR homogenous staining region Double minute ou épisome

20 20 HER2 MET

21 21 amplifications Genes cmet amplification 5 copies avec ratio MET/cen7 >2 dans 10% des cellules ou >6 copies en moyenne sur 100 cellules FGFR1 EGFR HER2 sein 6 copies avec ratio FGFR/cen8 >2 dans 10% des cellules Ratio EGFR/cen7 >3 dans 10% des cellules Asco 2009 HER2/cen ou nombre moyen de HER2 6 Non amplifié si HER2/cen17 <1.8 Actualisation en 2013 GEFPICS 2014 >6 amplifié <4 non amplifié Zone grise entre les deux Entre 4 et 6 si ratio HER2/cen17<2 non amplifié si >2 amplifié

22 Masse de la cuisse évoluant depuis 5 ans 22

23 MDM2 23

24 Profils possible avec les sondes de split 24

25 Fusion Genes in Sarcoma (35%) 25 Sarcoma type Chromosomal transl. Fusion gene Ewing s sarcoma t(11;22)(q24;q12) EWS-FLI1 t(21;22)(q22;q12) EWS -ERG Clear cell sarcoma t(12;22)(q13;q12) EWS -ATF1 Desmoplastic small round cell tumor t(11;22)(p13;q12) EWS -WT1 Extraskeletal myxoid chondrosarcoma t(9;22)(q22;q12) EWS -CHN Myxoid liposarcoma t(12;16)(q13;p11) TLS/FUS-CHOP t(12;22)(q13;q12) EWS CHOP/DTIT3 Angiomatoid fibrous histiocytoma t(12;16)(q13;p11) TLS/FUS-ATF1 Alveolar rhabdomyosarcoma t(2;13)(q35;q14) PAX3-FKHR-FOXO1 t(1;13)(p36;q14) PAX7-FKHR-FOXO1 Extraskeletal myxoid chondrosarcoma t(9;17)(q22;q11) TAF2N-CHN Synovial sarcoma t(x;18)(p11;q11) SYT-SSX1,2 Dermatofibrosarcoma protuberans t(17;22)(q22;q13) COL1A1-PDGFB Congenital fibrosarcoma t(12;15)(p13;q25) ETV6-NTRK3 Inflammatory myofibroblastic tumor t(2p23) Various ALK fusions Alveolar soft part sarcoma t(x;17)(p11;q25) ASPL-TFE3 Endometrial stromal sarcoma t(7;17)(p15;q21) JAZF1-JJAZ1

26 Tumeurs d Ewing FISH sur coupes en paraffine 26 N N N N Patient EWS 1 1 signal normal bicolore (N), 1 signal rouge et 1 signal vert séparés N N N N N Patient EWS 2 2 signaux normaux bicolores (N), 1 signal rouge et 1 signal vert séparés Patient EWS 3 : fusion EWS/NFATc2 (amplification) Sonde LSI EWSR1 (Vysis)

27 27 ALK dans le poumon Inversion paracentrique ALK-EML4 2p23-2p21 Estimation de la distance entre les deux signaux pas toujours facile Possibilité de la perte d un signal vert Seuil de positivité de 15% Grande hétérogéneité tumorale

28 Homme de 64 ans-tumeur pulmonaire. 28

29 IHC ALK D4F5 29

30 IHC ALK D4F5 30

31 31 Polyploidie et polysomie des tumeurs ROS1 FISH ROS1 Zytovision

32 Femme de 35 ans-biopsie exérese d'une adénopathie mésentérique. 32

33 33 CD20 CD5

34 34 BCl2 CD10

35 FISh region 3 35

36 FISH region 4 36

37 37 Importance du pré analytique Grande aide au diagnostic Étude retrospective possible Conservation architecture tumorale Particularités liées aux pathologies étudiées Importance du contexte clinique

38 38 STIC Gensar (en cours de publication) ITALIANO A et al 2015

39 39 STIC Gensar (en cours de publication) ITALIANO A et al 2015

40 40 STIC Gensar (en cours de publication) Aide de l analyse moléculaire dans la prise en charge du patient dans 15-20% des DFSP, DDLPS et SS et jusqu a 48% des ARMS. Le bénéfice est moins important dans les MLPS (4%). Discordance histologie morphologique, IHC et analyse moléculaire diagnostic initial de perineurome, tumeur bénigne du SNP (CD34+) Diagnostic différenciel avec schwannoma et neurofibrome. Rarement avec DFSP. Dans notre cas, fusion COL1A-PDGFB.reprise chirurgicale Diagnostic le plus probable de SS pulmonaire Pas de gene de fusion SS18-SSX en RT-PCR, pas de rearrangement par FISH. diagnostic de carcinome sarcomatoide. Traitement par cisplatine.