UER Stratégies en histologie moléculaire. Démarches et intérêts de la mise en culture de cellules et de tissus

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1 Démarches et intérêts de la mise en culture de cellules et de tissus Novembre 2012

2 CULTURE CELLULAIRE Historique Terminologie Nature des cellules pouvant être cultivées Avantage et inconvénients Bases des méthodes de cultures Champs d utilisation

3 Terminologie Culture d organe : survie d un fragment d organe ou de tissu en conservant son intégrité et son architecture Culture organotypique Culture de cellules : maintien hors de l organisme de cellules non organisées en tissu (dissociées) mais capables d exprimer in vitro leur métabolisme et fonctions spécifiques 1.Culture primaire : dérive de cellules directement extraites d un organisme multicellulaire - culture organotypique - cellules dissociées 2. Culture secondaire = Lignée cellulaire : dérive d une primoculture après le 1er repiquage - lignées cellulaire à durée de vie limitée (sénésence : Télomères, molécules toxiques, radicaux libres) - lignées cellulaires à durée de vie illimitée : 3 sources - lignées obtenues spontanément en culture - lignées établies à partir de certains tissus tumoraux (HeLa cells) - lignées immortalisées ou transformées (surexpression d oncogènes viraux : SV40, EBV) Co-culture de cellules

4 Culture primaire de neurones dissociés de striatum Culture organotypique de striatum Lignée lymphoblastoïde

5 Nature des cellules pouvant être cultivées Cellules différenciées Cellules épithéliales Cellules fibroblastiques Cellules nerveuses Cellules musculaires Cellules hématopoïétiques Cellules amniotiques Cellules souches Germinales Embryonnaire Adulte Pluripotentes induites

6 Nature des cellules pouvant être cultivées : exemple (1) fibroblaste Cellules musculaires GRD : myéline hépatocytes

7 Cellules HeLa : cancer du col de l utérus The woman from which the HeLa cells are derived was named Henrietta Lacks, and she was a wife and mother of five when she passed away at John Hopkins University at the age of thirty-one in A sample of one of her tumors was sent to George and Maragret Gey who had been seeking a line of human cells that would survive indefinitely outside the body for research purposes. The tumor cells they received multiplied like nothing they had ever seen before and soon the cells, dubbed HeLa in a truncated form of Lacks' name, were being shipped to their colleagues stationed around the world. The cells later became a laboratory standard and have even been grown in space.

8 Nature des cellules pouvant être cultivées : exemple (2) Neurones dopaminergiques Immunohistochimie anti tyrosine hydroxylase

9 . Phase MAP2 GFAP Tau1

10 Avantages et inconvénients Avantages Les cellules gardent généralement les propriétés des cellules initialement mises en culture Accessibilité - maniabilité Homogénéité de la culture Contrôle du milieu extérieur inconvénients Peux ne pas reproduire la situation in vivo Dédifférenciation cellulaire

11 Conditions matérielles nécessaires pour la culture cellulaire

12 Laboratoire L1 Cellules animales non transformées Confinement modéré Hotte à flux laminaire Laboratoire L2 Cellules humaines non transformées Sas d accès Hotte de type II Pièce en surpression Décontamination manuelle Laboratoire L3 Cellules humaines transformées ou infectées par un virus dangereux Habillage obligatoire Sas en surpression Pièce en dépression Autoclave de tout ce qui sort de la pièce Laboratoire L4 Cellules infectées par virus mortel au mode de contamination non connu (Ebola)

13 Environnement pour les cellules en culture Nature du support Nature du milieu de culture

14

15 Nature du milieu de culture Doit reproduire les conditions auxquelles sont exposées les cellules in vivo

16 -Source d énergie et de carbone : le glucose, pyruvate -Ions minéraux -La glutamine -Les acides aminés : précurseurs de la synthèse protéique -Vitamines -Système tampon HCO 3- /CO2 -Osmolarité -Antibiotiques - antifongiques -CO2 -T Nature du milieu de culture (2)

17 Roles du serum

18 Inconvénients du serum

19 Milieu chimiquement défini -Hormones -Facteurs de croissance -Protéines de transport -Sélénium -Putrescine -Acides gras

20 Contrôle de la viabilité des cultures Examen au microscope inversé à contraste de phase - morphologie - attachement au support - densité cellulaire - pollution Contrôles fonctionnels

21 Conservation des cellules Conservation A ultra-basse température C préservation > 10 ans maximum de stabilité génétique A 80 C pour des périodes courtes (quelques mois) Conditions de congélation abaissement progressif de la température jusqu à 70, -100 C utilisation d agent cryoprotecteur (DMSO) dans mileu de culture avec sérum à 10 7 cellules/ ml

22 Champs d application Recherche : fondamentale et appliquée Diagnostic Génétique Virologie Biopharmacie Pharmacotoxicologie Thérapie cellulaire

23 Recherche fondamentale : un exemple : l étude du trafic de récepteurs Témoin RD1-Cy3 SKF h RD1-Cy3

24 témoin SKF h SKF h Témoin SKF min Tf-alexa 488 Tf-alexa 488 RD1-Cy3 RD1-Cy3 Superposition Superposition

25 Virologie -Diagnostic : techniques d isolements de virus en cultures cellulaires de plus en plus abandonnées au profit des techniques de détection des antigènes viraux et surtout de celles d acides nucléiques (PCR). -caractérisation des types de souches virales : épidémies, recherche de mutations. -Effet des traitements virucides -Résistance au traitement : HIV, CMV, HBV). MRC5 :fibroblastes pulmonaires embryonnaires humains. Cellules vero cellules épithéliales de rein de singe

26 Figure 1 Effets cytopathiques, observés à l état frais, des virus herpès simplex, varicelle zona et cytomégalovirus. L herpès simplex virus de type 1 produit la formation de grosses cellules arrondies, souvent groupées initialement en foyers puis envahissant toute la nappe cellulaire, alors que l ECP du type 2 comporte souvent de petits syncytia. Les ECP des virus herpès simplex apparaissent rapidement, en 2 à 4 jours, en MRC5 et en cellules Vero. Le virus varicelle zona induit, en MRC5, l apparition de cellules irrégulières, toujours disposées en foyer, sous forme de plages granuleuses. Les cellules sont plus arrondies lorsque le virus est cultivé en cellules Vero (non présenté). Le cytomégalovirus donne des foyers de grandes cellules disposées en bancs de

27 Biopharmacie Utilisation de cultures cellulaires produite à grande échelle (industriel) - pour amplification de particules virales (vaccin) - Pour la production de protéines recombinantes ou d anticorps - Pour la production de virus (ex adénovirus) pour la thérapie génique - Pour la thérapie cellulaire

28 Intérêts de la production de protéines ou d anticorps recombinants

29 Pharmaco/toxicologie Estimation de la toxicité d une molécule Utilisation de cellules peu différenciées (fibroblastes) ou différenciés ex kératinocytes Etude des effets in vivo d un médicament Utilisation de : hépatocytes, cellules CHO surexprimant une isoformede cytochrome P450, entérocytes.. (CHO (Chinese Hamster Ovary)) Réalisation de tests fonctionnels rapides et à haut débit de screening de molécules Ex cellules CHO surexprimant un récepteur couplé aux protéines G

30 Production de protéines thérapeutiques -Facteurs sanguins -Hormones -Facteurs de croissance - Interféron cytokines -Vaccins -Anticorps Principales lignées utilisées pour la production d anticorps -CHO -Lignées lymphoïdes dérivées de plasmocytomes murins -Hybridomes

31 Nature des protéines recombinantes Classe de protéines Hormones Facteurs sanguins Interférons Interleukines Facteurs de croissance Cytokines Enzymes Protéines recombinantes Insulines Hormones de croissance Facteurs de la coagulation Antithrombine Thrombolytiques, rtpa IFN-a, b, g Anticorps anti-il 1 Anticorps anti-il 2 Erythropoïétine G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor) Anti-TNF-a (Tumor Necrosis Factor) Imiglucerase Agalsidase Laronidase Alglucosidase alfa Idursulfase Galsufase Domaines thérapeutiques Diabète Déficit de croissance chez l'enfant Troubles de la coagulation Cancers Maladies inflammatoires Transplantation rénale Anémies Neutropénies Maladies inflammatoires Maladies de surcharge lysosomales

32 Anti TNF alpha Anti VEGF Anti CD20 Anti TNF alpha erythropoïetin Anti HER2/neu receptor Insulin GCSF (granulocyte colo erythropoëtin -Indications -Anti TNF : pathologies inflammatoires chroniques -Anti VEGF : pathologie cancéreuse -Anti HER2/neu : cancer du sein GCSF (granulocyte colony stimulating factor)

33 Classification fonctionnelle des anticorps monoclonaux approuvés

34 Thérapie cellulaire

35 Un exemple : Greffes cutanées