Chapitre II. Les mutations et les systèmes enzymatiques de réparation et de recombinaison de l ADN

Transcription

1 Chapitre II. Les mutations et les systèmes enzymatiques de réparation et de recombinaison de l ADN 1

2 Sommaire 1. Les mutations 2. Les systèmes de réparation de l ADN 3. La recombinaison homologue 2

3 1. Les mutations 1.1 Définitions vs. référence? - mutation : changement de la séquence nucléotidique (d un gène, d un génome,..) allèle sauvage x allèle mutant x allèle mutant Au laboratoire : pour chaque organisme modèle (E. coli, levure, poisson zèbre, A. thaliana, souris,..), on définit une variété, souche, lignée sauvage de référence, à partir de laquelle des mutants sont isolés : allèle sauvage (référence) -> allèle mutant. 3

4 Dans la nature : chaque gène d'une espèce est typiquement représenté par plusieurs allèles (chaque allèle est présent à une certaine fréquence au sein de la population), c'est le polymorphisme génétique naturel. Un allèle particulier est parfois associé à une pathologie. Référence? L allèle le plus fréquent d'un gène pourrait en principe être considéré comme l allèle de référence, mais dans la pratique, l allèle de référence est en général celui qui a été séquencé en premier, ou séquencé lors d un programme de séquençage du génome complet. Ex. génome humain, version GRC38h = référence Projet 1000 genomes : recensement de 88 millions de variations génétiques. Typiquement, le génome d un individu présente entre 4 et 5 millions de différences par rapport à la séquence de référence (GRC38h). - génotype : définition des allèles - ex. individu diploïde A B c A b c - phénotype : propriétés ou caractères visibles déterminé par le génotype (génétique) mais aussi par le niveau d expression des gènes (épigénétique) 4

5 1.2 Les mutations surviennent de manière aléatoire cad : sans rapport avec l éventuel effet qu aura la mutation sur l organisme Observation en laboratoire de l'apparition de mutants de E. coli : dépôt de millions de cellules colonies de E. coli St S et T1 S (issues chacune d'une seule bactérie) milieu + St milieu + T1 incubation pendant une nuit mutation = réponse adaptative au milieu ou phénomène qui survient aléatoirement avant le contact avec le milieu sélectif?? St : streptomycine T1 : virus (St s : sensible à la streptomycine) apparitions de qqes mutants St R apparitions de qqes mutants T1 R 5

6 Joshua Lederberg = contrôle de la réplique Lederberg & Tatum,

7 L'expérience historique de Lederberg et Tatum (1952) : réplique sur deux milieux sélectifs identiques et incubation incubation une nuit à 37 C mutant résistant milieu sélectif (ex. T1, ou antibiotique,..) étalement de 10 6 de cellules de E. coli sur un milieu non sélectif "tapis" de E. coli (colonies confluentes) Observation : après une incubation d'une nuit à 37 C, on constate l'apparition de quelques mutants aux mêmes endroits des deux boites de milieu sélectif. Les mutants étaient donc déjà présents sur la boite mère, ils ne sont pas apparus suite au contact avec l agent sélectif Conclusion : Les mutations surviennent de manière aléatoire, sans rapport avec une éventuelle utilité pour l organisme 7

8 rem : dans sa théorie, C Darwin avait déjà proposé que les variations héréditaires surviennent au sein des espèces de manière aléatoire c'est l'un des principaux fondements de sa théorie et de tous les développements scientifiques qui s'en sont suivis Les divers mouvements créationnistes, au contraire, rejettent ce principe : Bruce Chapman Discovery Institute, USA Harun Yahya Scientific Research Foundation, Turquie Théorie de l' "Intelligent design" : Les mutations surviennent de manière "orientée", "intentionnelle" pour générer à terme une fonction, un mécanisme, un organe,... selon un plan prédéfini ("design") "Toutes les espèces (et leurs génomes) ont été créées, l'évolution des espèces est un mythe" "Le seul effet des mutations est d'altérer, de détruire les fonctions biologiques " 8

9 rem : les "mutations adaptatives" de J. Cairns (1988) ou la proposition par John Cairns d'une évolution "lamarckienne" chez E. coli L'expérience : mesure des fréquences de réversion lac en lac + lac - lac + sur un milieu lactose f 1 lac - lac + sur un milieu contenant une autre source carbonée f 2 Observation : f 1 >> f 2 Conclusion de J. Cairns : les mutations "utiles" surviennent plus fréquemment!! La vraie explication (suite à des travaux ultérieurs) : la fréquence globale des mutations spontanées dans le génome tend à augmenter dans les conditions de stress cellulaire (ex. carence nutritionnelle, comme le mutant lac - sur le milieu lactose ) avantage pour l organisme? Autre observation : un gène abondamment transcrit a une probabilité plus élevée de subir des mutations (mais celles-ci restent, au sein du gène, aléatoires..). 9

10 1.3 Types de mutations et causes immédiates Mutations ponctuelles (single mutations) a) substitutions (ou SNPs : Single Nucleotide Polymorphisms "snip") : types : transition (purine remplacée par l'autre purine, ou pyrimidine par l'autre pyrimidine), 4 types transversion (purine remplacée par une des deux pyrimidines, ou vice-versa), 8 types origine : tautomérisation des bases, ou altérations chimiques comme la désamination (ex. C U, méthyl-c T), l oxydation de bases par radicaux de l'0 2 (ex. G 8-oxo-G, qui s apparie préférentiellement à la base A) Chaque base existe sous forme de deux isomères, un stable (base classique) et l'autre très instable et dont les propriétés d'appariement sont différentes... l'interconversion entre isomères se produit par le déplacement d'un atome d'hydrogène (tautomérisation) 10

11 C A C* A C la base C bascule par tautomérisation dans la conformation imine juste au moment d être répliquée anomalie: mésappariement G C G U la base C subit une désamination et bascule par tautomérisation dans la conformation stable uracile double anomalie: base U et mésappariement G C G 8-oxo C la base G subit une oxydation double anomalie: base 8-oxo-G et mésappariement Ces différentes anomalies dans l ADN ne sont pas des mutations. Ces anomalies peuvent par contre causer l'apparition de mutations de substitution si l'adn est répliqué avant l'intervention des systèmes de réparation de l'adn 11

12 Ex : anomalie A C A T G C mutation anomalie G U G C A U anomalie dans ce cas, l anomalie aboutira à la mutation A::T (transversion) après réplication ou réparation de l ADN (U remplacé par réparation en T) 12

13 b) insertion ou délétion de 1 nt (ou "INDELs") Souvent au niveau de séquences répétées en tandem : - par "glissement" des brins d'adn (durant la réplication) : glissement de l'adn néosynthétisé glissement de l'adn matrice Le (ou les) nucléotide(s) "en dehors" de la double hélice sont en principe éliminés par certains mécanismes de réparation de l'adn, sauf si l ADN est à nouveau répliqué - par recombinaison (crossing-over inégal ou décalé) : recombinaison 13

14 1.3.2 Les réarrangements chromosomiques Les mutations correspondent parfois des insertions, délétions, inversions, duplications en tandem, ou translocations : rôle crucial au cours de l évolution.. le plus souvent issues d'évenements de recombinaison au niveau de séquences répétées (ex. transposons, LINEs, SINEs) 14

15 1.4 Conséquences des mutations - Mutations dans l'orf d'un gène : Substitutions ponctuelles (SNPs) : - m. silencieuse : aa inchangé (ex. codon AGG > Arg codon CGG > Arg) - m. faux-sens ("missense") : aa remplacé par un autre (ex. AGG > AGC > Ser) - m. non-sens : aa remplacé par "stop" (si codon remplacé par UAG = mutation amber, par UAA = m. ochre, par UGA = m. umber ou opal) NH 2 NH 2 COOH COOH protéine tronquée du côté C-terminal Délétions/insertions d'un ou qqes nt (INDELs) : - provoque le plus souvent un décalage du cadre de lecture (frameshift) : NH 2 COOH NH 2 COOH - Les mutations peuvent aussi altérer les séquences régulatrices, le promoteur, les sites d'épissage d'un gène, 15

16 Diversité des mutations altérant un même gène (allèles) Ex 1 gène ATM, associé au syndrome de Louis-Bar (nombreux symptômes dont un risque accru de cancers), impliqué dans la réparation de l'adn : Barres bleues = exons La protéine ATM fait 3056 aa 16

17 Ex 2 gène PAX3, codant pour un facteur de transcription de 483 aa impliqué dans le développement fœtal, associé à différentes pathologies (malformations) : Les introns ont ici été raccourçis pour représenter les exons en grand format Cette partie de Pax3 (domaine "paired") semble très importante pour la fonction de la protéine car les mutations faux-sens sont particulièrement abondantes à cet endroit Barres bleues foncées = exons, dont des parties sont colorées en oranges, vert. Zone en orange = domaine "paired" de la protéine (sur exons 2, 3 et 4) Zone en vert = "homéodomaine" de la protéine (sur exons 5 et 6) 17

18 rem : diversité des mutations recensées dans le génome humain (projet 1000 K) : - recensement d environ 88,4 millions de mutations / variations génétiques ~ 95% = SNPs ~ 4% = INDELs ~ 0,05% = réarrangements chromosomiques - la plupart de ces variations sont rares : 64 millions f < 0,5% 12 millions 0,5 < f < 5% ~ 8 millions f > 5% - un génome séquencé contient typiquement : 4-5 millions de variations (vs. séquence de référence) la plupart sont communes, seulement à présent une f < 0,5% > 99 % des variations = SNPs et INDELs Le reste : ~ 1000 délétions, ~ 160 variations du nombre de copies, ~900 insertions Alu, ~130 insertions L1, ~10 inversions,... Parmi ces variations, environ altèrent la séquence d acides aminés de protéines, dont 150 à 200 qui sont de type protein truncating 18

19 1.5 Notions de réversion et de suppression (intragénique, extragénique, non-sens) mutant de bactérie auxotrophe pour l histidine (His - ) étalement de millions de cellules rares clones His + milieu sans histidine incubation pdt qqes jours - Réversion : allèle muté - mutation 2 aire allèle sauvage - Suppression intragénique : une mutation secondaire dans le même gène compense l'effet de la première - Suppression extragénique : une mutation secondaire dans un autre gène compense l'effet de la première - Suppression non-sens : mutation primaire de type non-sens est partiellement compensée par une mutation secondaire dans un gène d'arnt 19

20 Ex. de scénario moléculaire d'une suppression intragénique : enzyme "sauvage" enzyme avec un acide aminé substitué enzyme avec deux acides aminés substitués allèle sauvage mutation primaire de perte de fonction mutation suppressive 20

21 Ex. de scénario moléculaire d'une suppression extragénique : allèles sauvages mutation mutation suppressive L'interaction entre les deux sous-unités d'un complexe peut être empêchée par une mutation affectant une des sous-unités et rétablie par une mutation suppressive affectant l'autre sous-unité Autre exemple de suppression extragénique : cf. cascade de régulations PHO (cf. chap. IV) 21

22 Principe de la suppression non-sens : C T G C T G Tous les gènes d'arnt sont présents en de multiples exemplaires rem : l anticodon de l ARNt se lit 5 -CUG-3 22

23 CTG CTG L'effet de la mutation non-sens dans le gène X peut être supprimée par la mutation supe 23

24 supe C T A C T G - Une fraction des événements de traduction de l'arnm du gène X incorpore l'arnt mutant (supe) ce qui permet la synthèse du polypeptide complet et le rétablissement de la fonction X (mais une fraction seulement -> la fonction X n'est en général que partiellement restaurée) - La croissance des mutants suppresseurs non-sens de E. coli (mutants sup) est en général plus lente que celle de la souche sauvage (en raison des événements fréquents de non-terminaison de la traduction des ARNm des gènes non-mutés > allongement du côté C-terminal des protéines) 24