Table des matières. Introduction Chapitre 1 ADN et ARN Chapitre 2 De l ADN aux protéines... 17

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1 Table des matières Intrductin Chapitre 1 AD et AR Fnctin des acides nucléiques Structure d un nuclétide et d un plynuclétide Cmplémentarité des brins de l AD et duble hélice Plarité d un brin d AD Histnes, chrmatine et chrmsmes Différences entre eucarytes et prcarytes Cycle de vie d une cellule Cycle cellulaire Divisin cellulaire : mitse Divisin cellulaire : méise Résumé Exercices Chapitre 2 De l AD aux prtéines Réplicatin Définitin Initiatin Réplicatin semi-cnservative Plarité de réplicatin Mécanisme Transcriptin Définitin Initiatin Élngatin du transcrit d AR messager Terminaisn Maturatin de l ARm Traductin Définitin

2 2.3.2 Cde génétique Initiatin Élngatin Terminaisn Structure des prtéines Résumé Exercices Chapitre 3 Enzymes de mdificatin de l AD Enzymes de restrictin Origine Utilité Mde de fnctinnement Sites de recnnaissance Digestin de l AD Digestin partielle et activité étile Autres enzymes de mdificatin de l AD Remplissage u digestin des extrémités saillantes Ligatin de fragments d AD Phsphrrylatin de l AD Déphsphrylatin de l AD Tampns de réactin Résumé Exercices Chapitre 4 Mutatins et transmissin des caractères génétiques Définitin Terminlgie Géntype et phéntype Haplïdie et diplïdie Dminance et récessivité Mutant et type sauvage Types de mutatins Mutatins chez les humains Mutatins récessives liées au chrmsme X Mutatins dminantes liées au chrmsme X Mutatins autsmiques récessives Mutatins autsmiques dminantes Plymrphisme Plymrphisme de lngueur de fragments de restrictin (RFLP) mbre variable de répétitins en tandem (VTR) Curtes répétitins en tandem (STR) Plymrphisme d un seul nuclétide (SP) Résumé Exercices Chapitre 5 Clnage mléculaire Définitin XII H H 2

3 5.2 Plasmides Vecteurs de clnage Cmpsantes de base Origine de réplicatin (ri) Gène de sélectin Site de clnage multiple Cmpsantes facultatives Marqueur de criblage Prmteur et terminateur de transcriptin Marqueur nutritinnel et rigine de réplicatin supplémentaire Épitpes Séquences brdant le site de clnage multiple Résumé Exercices Chapitre 6 Techniques d analyse de l AD Analyse sur gel d agarse Préparatin et chargement d un gel d agarse Migratin de l AD Migratin de l AD seln sa cnfrmatin tridimensinnelle Migratin de l AD seln la taille des mlécules Migratin de l AD seln la charge des mlécules Visualisatin de l AD dans un gel d agarse Analyse de la cncentratin de l AD Dsage de l AD à l aide d un gel d agarse Dsage de l AD par spectrphtmétrie Dsage de l AD à l aide de clrants flurescents Analyse sur gel de plyacrylamide Prtcles Quelques ntes sur la manipulatin de l AD Préparatin d un gel d agarse Préparatin des slutins Préparatin du gel Préparatin des échantillns Migratin et visualisatin de l AD Préparatin d un gel de plyacrylamide (nn dénaturant) Préparatin des slutins Préparatin du gel Préparatin des échantillns Migratin et visualisatin de l AD Résumé Exercices Chapitre 7 Utilisatin d Escherichia cli en bilgie mléculaire Transfrmatin d une bactérie par un plasmide Définitin de la transfrmatin Transfrmatin par la chaleur Électrpratin XIII h

4 7.1.2 Suches utilisées Sélectin u criblage des transfrmants Extractin d AD plasmidique Mini-préparatin Midi-préparatin et maxi-préparatin Prductin et purificatin de prtéines recmbinantes Système d inductin Principales étiquettes utilisées Prtcles Transfrmatin par la chaleur Préparatin des slutins Transfrmatin Mini-préparatin d AD plasmidique Préparatin des slutins Mini-préparatin d AD plasmidique («mini-prep») Purificatin d une prtéine à l aide de sn étiquette histidine Préparatin des slutins Purificatin des prtéines A. Culture bactérienne et inductin de la prtéine B. Préparatin de l extrait cellulaire C. Préparatin de la clnne d affinité D1. Purificatin de la prtéine (cas d une prtéine sluble, surnageant A) D2. Purificatin de la prtéine (cas d une prtéine insluble, surnageant B) Résumé Exercices Chapitre 8 Étapes détaillées d un clnage mléculaire Cartes de restrictin Étapes d un clnage mléculaire Élabratin d une stratégie de clnage Chix du vecteur et de l insert Chix des sites de restrictin A. Si pssible, chisir des sites de restrictin chésifs entre eux B. Chisir des sites différents de chaque côté du vecteur et de l insert C. Chix de site unique dans le vecteur D. Chix de site unique dans l insert E. Chisir des enzymes de restrictin curamment utilisées F. Vérifier la cmpatibilité de réactin entre les enzymes chisies Déphsphrylatin du vecteur Autres pints à planifier Digestin du vecteur et de l insert Purificatin du vecteur et de l insert sur gel Déphsphrylatin du vecteur Changement de tampn de réactin Ligatin de l insert avec le vecteur Digestin pst-ligatin de prduits nn désirés Témins Transfrmatin de la bactérie avec le prduit de ligatin Sélectin u criblage des transfrmants XIV H H 2

5 Identificatin des clnes cntenant la cnstructin recherchée Entrepsage des transfrmants intéressants Prtcles Précipitatin de l AD Préparatin des slutins Précipitatin de l AD Extractin d AD à partir d un gel d agarse Préparatin des slutins Extractin d AD à partir d un gel d agarse Résumé Exercices Chapitre 9 Réactin de plymérisatin en chaîne u PCR Principe du PCR Dénaturatin de l AD Hybridatin des amrces Plymérisatin Prductin d un grand nmbre de cpies d un fragment d AD grâce à l enchaînement de plusieurs cycles Température de fusin (T m ) d un fragment d AD Cnstituants essentiels d un mélange réactinnel de PCR AD matrice Amrces cmplémentaires au fragment cible Désxynuclétides Plymérase thermrésistante Tampn de réactin Utilités fréquentes d un PCR Ajut de séquences Clnage d un fragment d AD amplifié par PCR dans un vecteur T Intrductin de mutatins dans un fragment d AD Amplificatin d un ensemble de fragments d AD Thermcycleur PCR en temps réel Méthdes de détectin de l AD amplifié Clrant SYBR green Sndes d hybridatin Sndes Taqman Balises mléculaires RT-PCR Analyse d une réactin de PCR Précautins à prendre au mment de préparer une réactin de PCR Prtcle de PCR Préparatin des slutins Préparatin des bactéries Prgrammatin du thermcycleur Préparatin du mélange réactinnel Analyse du prduit de réactin Résumé Exercices XV h

6 Chapitre 10 Sndes nucléiques Marquage des sndes avec des grupements radiactifs Radiactivité Utilisatin d istpes radiactifs en bilgie mléculaire Radiprtectin Demi-vie des istpes radiactifs Marquage d un fragment d AD Marquage interne A. Marquage aléatire B. Marquage d un fragment d AD par PCR Marquage aux extrémités A. Marquage par incrpratin de nuclétides marqués B. Marquage en 5 par un phsphate radiactif Marquage d AR Autres méthdes de marquage Chimiluminescence Enlèvement des nuclétides libres Prtcles Marquage aléatire d un fragment d AD duble brin Préparatin des slutins Marquage de l AD Marquage en 5 d un phsphate radiactif par une réactin d échange Préparatin des slutins Marquage de l AD Résumé Exercices Chapitre 11 Séquençage de l AD Principe Autmatisatin Séquençage du génme humain Résumé Exercices Chapitre 12 Extractin et analyse de l AD Analyse in vitr de l AD Extractin et purificatin de l AD Buvardage à la Suthern (Suthern blt) Digestin et migratin de l AD Transfert de l AD A. Type de tampn de transfert B. Type de transfert Fixatin de l AD sur la membrane Hybridatin Lavages et expsitin de la membrane Analyse in viv de l AD Carytypage Anmalies chrmsmiques XVI H H 2

7 A. Anmalies de nmbre B. Anmalies de structure Hybridatin in situ Hybridatin in situ par flurescence (FISH) Hybridatin génmique cmparative (CGH) Peinture chrmsmique Élngatin d amrce in situ (PRIS) Prtcles Extractin d AD à partir de prélèvements sanguins Préparatin des slutins Extractin de l AD Extractin d AD à partir de queues de suris Préparatin des slutins Extractin de l AD Buvardage à la Suthern Préparatin des slutins Digestin de l AD Migratin de l AD Transfert A. Traitement du gel B. Préparatin de la membrane et des papiers de transfert C. Préparatin du mntage de transfert D. Transfert Hybridatin Lavages Expsitin Résumé Exercices Chapitre 13 Analyse de l AR Enzymes qui dégradent l AR : les Rases Surces de cntaminatin par les Rases Extractin de l AR Extractin à l isthicyanate de guanidine Purificatin de l ARm Dsage de l AR Analyse de l ARm Buvardage à la nrthern RT-PCR Puces à AD Exemple d applicatin des puces à AD Analyse de la lcalisatin de l AR par hybridatin in situ Autres méthdes d analyse de l AR Prtcles Extractin de l AR Préparatin des slutins Extractin de l AR RT-PCR Préparatin des slutins XVII h

8 Transcriptin inverse PCR Résumé Exercices Chapitre 14 Analyse des prtéines Extractin des prtéines Purificatin des prtéines Précipitatin différentielle des prtéines Chrmatgraphie sur clnne Stabilité des prtéines Dsage des prtéines Méthde spectrphtmétrique Méthdes clrimétriques Électrphrèse des prtéines Gels de plyacrylamide dénaturants (SDS-PAGE) Gels de plyacrylamide natifs Électrphrèse en deux dimensins Clratin des prtéines d un gel Buvardage à la western (western blt) Types d anticrps Séquençage de prtéines Analyse des prpriétés enzymatiques des prtéines Analyse des interactins prtéine-prtéine Cimmunprécipitatin Cpurificatin en chrmatgraphie Duble hybride FRET Interactins prtéine AD Retardement sur gel Immunprécipitatin de la chrmatine (ChIP) Analyse de la lcalisatin des prtéines Immunhistchimie et immunflurescence Étiquette GFP Prtcles Dsage des prtéines Préparatin des slutins Méthde spectrphtmétrique Méthde de Bradfrd Électrphrèse des prtéines sur gel de plyacrylamide-sds (SDS-PAGE) Préparatin des slutins Préparatin du gel A. Mntage des vitres B. Gel de séparatin 10 % ( 10 ml) C. Gel de cncentratin 5% ( 4ml) Mntage du gel dans l appareil Préparatin des échantillns Migratin des prtéines Clratin au bleu de Cmassie XVIII H H 2

9 Préparatin des slutins Clratin du gel Buvardage à la western Préparatin des slutins Transfert des prtéines Blcage de la membrane Incubatin avec les anticrps et lavages Révélatin Résumé Exercices Chapitre 15 Utilisatin des techniques de bilgie mléculaire en milieu clinique Maladies génétiques héréditaires Hémchrmatse héréditaire (HH) Méthdes diagnstiques classiques Méthdes diagnstiques mléculaires A. PCR cmbiné à l analyse des sites de restrictin B. PCR allèle spécifique Syndrme du X fragile Méthdes diagnstiques A. Méthde d analyse du gène FMR1 par buvardage à la Suthern B. Méthde d analyse du gène FMR1 par PCR Autres maladies génétiques héréditaires Onclgie Leucémie myélïde chrnique (LMC) Méthdes diagnstiques A. Identificatin du chrmsme de Philadelphie par carytypage B. Identificatin de la translcatin t(9;22) par FISH C. Identificatin de l ARm hybride BCR/ABL par RT-PCR Autres types de leucémies dnt le diagnstic mléculaire est pssible Maladies infectieuses Chlamydia et gnrrhée Méthdes diagnstiques classiques Méthdes diagnstiques mléculaires A. Prélèvements et préparatin des échantillns B. Amplificatin des cibles C. Détectin des amplicns Autres maladies infectieuses Identificatin d individus Analyse des plymrphismes Analyse des VTR Analyse des STR Analyse des STR du chrmsme Y Analyse de l AD mitchndrial Analyse des SP Résumé XIX h

10 Chapitre 16 Série de labratires Diagnstic mléculaire de l hémchrmatse héréditaire de type Extractin d AD à partir de prélèvements sanguins Détectin de la mutatin C282Y par PCR allèle spécifique Préparatin des mélanges réactinnels Migratin sur gel d agarse des réactins de PCR Diagnstic de la leucémie myélïde chrnique Extractin d AR à partir de prélèvements sanguins Préparatin des slutins Extractin de l AR A. Purificatin des glbules blancs B. Extractin de l AR Transcriptin inverse de l ARm en ADc Première rnde de PCR Deuxième rnde de PCR Migratin sur gel d agarse Élabratin d une stratégie pur le diagnstic mléculaire du syndrme du X fragile Recherche de la séquence du prmteur et du gène FMR1 dans des bases de dnnées publiées dans Internet Créatin d amrces de PCR pur amplifier un fragment apprprié Clnage de la snde Chapitre 17 Série de labratires Préparatin du gène cdant pur le facteur σ 32 d Escherichia cli Amplificatin du gène par PCR Vérificatin du PCR sur gel d agarse Purificatin du fragment de PCR Clnage du gène dans un vecteur d expressin Digestin de l insert et du vecteur Vérificatin et purificatin des digestins sur gel d agarse Ligatin de l insert et du vecteur, puis transfrmatin Vérificatin du clnage Inductin de l expressin de la prtéine et purificatin par chrmatgraphie d affinité Transfrmatin de la bactérie BL21(DE3) Inductin de l expressin et purificatin de la prtéine de fusin Vérificatin de la purificatin de la prtéine de fusin Gel SDS-PAGE Immundétectin de la prtéine par buvardage à la western Annexe I Crrigé des exercices Annexe II Aide mémire Médiagraphie Glssaire Index XX H H 2

11 Liste des tableaux Tableau 1.1 Structure des cmpsantes des acides nucléiques Tableau 1.2 Principales différences entre prcarytes et eucarytes Tableau 1.3 Différences entre la mitse et la méise Tableau 2.1 Cde génétique Tableau 3.1 Quelques enzymes de restrictin cmmunes et leur site de recnnaissance Tableau 3.2 Exemple d une réactin de digestin avec une enzyme de restrictin Tableau 3.3 Enzymes de mdificatin de l AD à utiliser seln le besin Tableau 7.1 Principaux antibitiques et cncentratins suggérées Tableau 7.2 Types de préparatins d AD plasmidique Tableau 7.3 Principales étiquettes utilisées pur la purificatin de prtéines Tableau 8.1 Exemple d une réactin de ligatin Tableau 9.1 Quantité d AD matrice à utiliser pur une réactin de PCR seln la surce de l AD Tableau 9.2 Efficacité de cupure de quelques enzymes de restrictin sur des extrémités d AD Tableau 10.1 Équivalence entre les unités de radiactivité Tableau 14.1 Purcentage de plyacrylamide requis seln la taille des prtéines à séparer Tableau annexe-ii.i Tableau péridique des éléments chimiques Liste des figures Figure 0.1 De la bilgie générale à la bilgie mléculaire Figure 1.1 Structure d un nuclétide Figure 1.2 Structure du pentse de l AD et de l AR Figure 1.3 Structure de l AD Figure 1.4 iveaux de cmpactin de la chrmatine Figure 1.5 Schéma d un cycle cellulaire typique Figure 1.6 Mitse Figure 1.7 Méise Figure 2.1 Réplicatin de l AD Figure 2.2 Réplicatin semi-cnservative Figure 2.3 Schéma d un gène et des éléments nécessaires à la transcriptin Figure 2.4 Maturatin d un ARm Figure 2.5 ARt et principales étapes de la traductin Figure 2.6 Hémglbine Figure 3.1 Digestin par des enzymes de restrictin Figure 3.2 Remplissage u digestin des extrémités saillantes Figure 3.3 Réactin catalysée par la plynuclétide kinase du phage T Figure 4.1 Transmissin des caractères dminants et récessifs :. expérience de mnhybridisme de Mendel Figure 4.2 Mutatins chrmsmiques et pnctuelles Figure 4.3 Types de mutatins transmissibles chez les humains Figure 4.4 Exemple de RFLP Figure 5.1 Exemple du clnage du gène de l insuline Figure 5.2 Présence de plasmides à l état naturel chez plusieurs bactéries Figure 5.3 Exemple d un vecteur de clnage : puc XXI h

12 Figure 5.4 Exemple d un site de clnage multiple Figure 5.5 Exemple d un criblage à l aide du gène lacz Figure 5.6 Exemple de vecteur navette bactérie-levure Figure 6.1 Exemple d appareil de migratin pur l électrphrèse de l AD sur gel d agarse Figure 6.2 Exemple d un gel d agarse clré au brmure d éthidium Figure 6.3 Cncentratin d agarse à utiliser seln la taille des fragments d AD à séparer Figure 6.4 Exemple de graphique pur déterminer la taille d un fragment d AD Figure 6.5 Exemple de calcul de cncentratin d AD Figure 6.6 Exemple d appareil de migratin pur l électrphrèse de l AD. sur gel de plyacrylamide Figure 6.7 Puvir de réslutin des gels de plyacrylamide Figure 7.1 Schéma d une transfrmatin Figure 7.2 Différence entre sélectin et criblage Figure 7.3 Mini-préparatin d AD plasmidique Figure 7.4 Exemple de surexpressin et de purificatin d une prtéine Figure 8.1 Cartes de restrictin Figure 8.2 Exemples de vecteurs de clnage Figure 8.3 Extrémités saillantes et chésives Figure 8.4 Différentes pssibilités d intrductin d un insert dans un vecteur. seln les extrémités créées par la digestin Figure 8.5 Purificatin sur gel d un fragment d AD digéré Figure 8.6 Déphsphrylatin du vecteur digéré Figure 8.7 Exemple de calcul pur respecter le rati d une mlécule de vecteur. pur cinq mlécules d insert Figure 8.8 Exemple d une cnfirmatin de clnage Figure 9.1 Schéma représentant quatre cycles d une réactin de PCR Figure 9.2 T m d un fragment d AD Figure 9.3 Ajut de séquences dans un fragment d AD amplifié par PCR Figure 9.4 Clnage d un fragment de PCR dans un vecteur T Figure 9.5 Le LM-PCR Figure 9.6 Phases d un PCR Figure 9.7 Méthdes de détectin de l AD amplifié Figure 10.1 Sndes nucléiques Figure 10.2 Marquage aléatire Figure 10.3 Marquage par remplissage d une extrémité 5 saillante Figure 10.4 Marquage par la plymérase à AD du phage T Figure 10.5 Marquage d un AR par transcriptin in vitr Figure 10.6 Exemple de chimiluminescence Figure 11.1 Séquençage seln la méthde de Sanger Figure 12.1 Détectin de l anémie falcifrme par buvardage à la Suthern Figure 12.2 Buvardage à la Suthern Figure 12.3 Psitin du centrmère sur un chrmsme Figure 12.4 Carytypes humains Figure 12.5 Détectin des sndes marquées Figure 12.6 Hybridatin in situ par flurescence (FISH) XXII H H 2

13 Figure 13.1 Puce à AD Figure 14.1 Exemples de chrmatgraphie Figure 14.2 Électrphrèse des prtéines sur gel de SDS-plyacrylamide Figure 14.3 Électrphrèse de prtéines en deux dimensins Figure 14.4 Buvardage à la western Figure 14.5 Cimmunprécipitatin Figure 14.6 Système duble hybride chez la levure Figure 14.7 Retardement sur gel Figure 14.8 Immunprécipitatin de la chrmatine Figure 15.1 Analyse mléculaire du gène HFE pur la présence de la mutatin C282Y par analyse des sites de restrictin Figure 15.2 Analyse du gène FMR1 par buvardage à la Suthern Figure 15.3 Chrmsme de Philadelphie Figure 15.4 Principe de la méthde diagnstique de la trusse Amplicr TM (test CT/G) Figure 15.5 Analyse de SP par micrséquençage Figure 16.1 Détectin de la mutatin C282Y par PCR allèle spécifique Figure 16.2 Dérulement des étapes du diagnstic mléculaire de la leucémie myélïde chrnique Figure 17.1 Cnstructin plasmidique XXIII h