TD de Génétique bactérienne (SV5)

Transcription

1 TD de Génétique bactérienne (SV5) 1/ On a étalé 10 8 cellules d E. coli mutante sur un milieu complet. Après incubation 24h à 37 C, on obtient un film bactérien. On réalise ensuite des répliques de ce film sur différents milieux minimums supplémentés avec tous les acides aminés sauf ceux indiqués. Après incubation, on obtient les résultats suivants : boîte mère (milieu complet) Val Val-Trp Trp His Leu Lac Gal Complet a) Quel est le but de cette manipulation et pourquoi on a fini par une réplique sur un milieu complet? b) Expliquer l apparition des colonies sur les boîtes répliques. 2/ le test d Ames a été réalisé sur l Ethinylestradiol (ET), un produit utilisé dans l industrie pharmaceutique. Le résultat du test après 48h d incubation à 37 C est le suivant : Boîte 1 (MM+His) : 10 6 UFC/ml Boîte 2 (MM sans His) : 10 UFC/ml Boîte 3 ( MM sans His + 50 µg/ml D ET + S 9 mix) : 100 UFC/ml Boîte 4 ( MM sans His µg/ml D ET + S 9 mix) : 200 UFC/ml Boîte 5 ( MM sans His + 50 µg/ml D ET, sans S 9 mix) : 80 UFC/ml a/ Quel est le but de ce test? b/ Préciser l utilité de chacune des boîtes (faire les calculs nécessaires). c/ Conclure sur le produit en argumentant. 3/ Deux souches bactériennes, E. coli et Staphylococcus aureus ont été soumises à un antibiogramme sur milieu solide pour voir leur sensibilité vis à vis de l Ampicilline. Le résultat après une incubation de 18 h à 37 C est le suivant : E coli : Diamètre = 21 mm S. A : Diamètre = 18 mm ( Zone avec un contour net et présence de cellules de grande taille ) diamètre (mm) 4 16 CMI ( mg/l)

2 a) Quel est le type de zone observée pour chacune des deux souches? (justifiez votre réponse) b) Laquelle des deux souches on va utiliser pour effectuer une transformation avec un plasmide pbr 322 portant la résistance à l Ampicilline?. On a transformée la souche choisie par 50 ng du plasmide pbr 322. On a sélectionné pour la résistance à l Ampicilline en étalant 0.1 ml de la culture (la culture a un volume total de 1 ml) sur des boîtes de milieu complet contenant l Ampicilline. Le résultat de la transformation est le suivant : Souche non transformée Souche transformée avec le PBR : 280 colonies 10-2 : 290 colonies 10-4 : : 35 c) Calculer le nombre de cellules viables/ml, le nombre de transformants/ml et l efficacité de transformation pour pbr322. 4/ Deux souches F - et Hfr ont été incubé à 37 C. F - est lac - mal - pro - leu Strp R. Hfr est lac + mal + pro + leu + Strp S.Après 40 min d incubation, un aliquot de la culture a été étalé sur un milieu minimum en présence de proline et de streptomycine. Les transconjuguants obtenus sont ensuite étalés par la méthode des répliques sur les milieux indiqués. Les résultats sont les suivants : MM + Pro, avec Strp 300 colonies MM 126 colonies MacKonkey +Mal 216 colonies roses et 84 blanches Milieu complet+xgal 96 colonies bleus 204 coloniesblanches a) Quel est le marqueur de sélection et celui de contre sélection? b) Quel est le génotype des colonies roses et blanches sur MacKonkey? des colonies bleues et blanches sur X-gal? c) Déterminer l ordre des gènes. X-gal : 5-Bromo-4 chloro-3-indol-β-galactoside 20 mg/ml dans le NN diméthylformamide. Ajouté dans les milieu à raison de 40 µg/ml. Milieu MacConkey agar : milieu solide additionné de sucre à 0.4% final. 5/ Décrire un protocol expérimental qui permet de forcer un plasmide F lac qui porte une mutation thermosensible affectant la réplication de son ADN ; à s intégrer dans le chromosome bactérien. 6/ Chez E. coli, quatre souches Hfr transfèrent une série des marqueurs génétiques dans l ordre suivant : Souche 1 : Q W D M T. Souche 2 : A X P T M. Souche 3 : B N C A X. Souche 4 : B Q W D M. Toutes ces souches sont dérivées de la même souche F+. Quel est l ordre des marqueurs sur le chromosome circulaire de la F+ d origine?

3 7/ On veut réaliser une transduction du gène hupa - ( hupa : : Kanamycine) porté par une souche E. coli hupa -, mal+, Leu+, dans une souche hupa + mal-, leu- pour la rendre également mutante pour le gène hupa. Pour ce faire, on a utilisé le bactériophage P1 : Le résultat obtenu après incubation de 24h à 37 C est le suivant : - Génotype du donneur : hupa - mal+ leu+ - Génotype du receveur : hupa + mal- leu- - Marqueur sélectionné : hupa - Résultats des marqueurs non sélectionnés : mal+ leu+ 3 colonies mal+ leu- 10 colonies mal- leu+ 24 colonies mal- leu- 13 colonies Total 50 colonies a) Etablir un protocole expérimental pour cette transduction ; Préciser l utilité du trisodium citrate. b) Calculer la fréquence de cotransduction des gènes mal+, leu+. c) Etablir l ordre des gènes hupa, mal et leu. 8/ On croise une souche Hfr lac + mal + leu + Str S avec une F - lac - mal - leu - Str R. Des expériences de conjugaison interrompue montrent que le marqueur lac + entre en dernier. On sélectionne donc les recombinants lac + sur milieu approprié. a/ Indiquer la composition du milieu de sélection (argumenter). b/ Préciser le génotype des recombinants lac + vis à vis des autres marqueurs? On a préparé une boîte mère des recombinants lac + sur milieu complet + X-Gal et on a recherché la présence des autres marqueurs. Pour chaque génotype, on a compté le nombre d individus: lac + mal + leu + : 330 lac + mal - leu + : 10 lac + mal - leu - : 60 lac + mal + leu - : 0 c/ Quelle est la couleur des colonies Lac + sur le milieu complet + X-Gal (argumenter) d/ Quel est l ordre des gènes (argumenter)? e/ Quelle est la distance cartographique en unités de recombinaison entre les locis lac et leu? 9/ analyse par complémentation dans des bactéries méroploïdes. Il y a 5 mutations liées qui affectent la capacité de la bactérie à synthétiser l arginine. Pour déterminer les groupes de complémentation, les mutations arg- sont combinées par paires (une sur un F arg, l autre dans le chromosome de la bactérie réceptrice). Le tableau donne les phénotypes Arg des méroploïdes combinant différentes paires de mutations arg. Mutation arg Déterminer les groupes de complémentation.

4 1/ 2/ Résumé du corrigé a) Déterminer le génotype de cette souche mutante val-, trp-, leu-, lac-. On réplique en dernier un milieu complet pour être sûre que les répliques se sont bien déroulés et que le résultat observé n est pas un artéfact dû à une mauvaise adhésion des cellules. b) L apparition de ces colonies est due à des mutations spontanées ( Ordre de 2 à ). Pour MM sans Val-Trp, On n a pas de mutants spontanés car il faut une double mutation : reversion vers trp+ et val+, ce qui est de l ordre de 10-14, or on a étalé seulement 10 8 cellules. a) On mesure la réversion des mutants his- vers his+. b) Car en général, il faut une activation enzymatique au niveau du foie pour rendre un produit mutagène. c) d) 3/ 4/ a) Voir si le ET est carcinogène ou non. b) Boîte 1 : nombre total des cellules viables. Boîte 2 : Nombre des révértants spontanés ; u= Boîte 3 : Nombre de révértants avec le ET ; u= Boîte 4 : Nombre des révértants avec une concentration plus élevée de ET ; u= 2x10-4, ce nombre augmente avec l augmentation de ET. Boîte 5 : voir si le ET est carcinogène sous sa forme primaire ou il nécessite une activation métabolique au niveau du foie. c) ET est carcinogène sous sa forme primaire (on compare avec le nobre des révértants spontanés). a) Pour E. coli, on observe une sensibilité. Dans l échelle de concordance, il faut une CMI inférieure à 4 mg/l d Ampicilline pour inhiber sa croissance. Pour S.A, on observe une inactivation enzymatique car même si SA est situé dans la zone intermédiaire, le fait d avoir un contour net avec des cellules de grande taille prouve que SA est résistant mais les bactéries qui sont trop près de l ATB n ont pas eu le temps de synthétiser l enzyme (β-lactamase) pour dégrader l ampicilline. b) E. coli. c) Nombre de cellules viables : 310x 10 3 x10 UFC/ml. Nombre de transformants : 320 x 10 2 x10 UFC/ml. Efficacité de transformation : 3,2x10 5 pour 50x10-3 µg d ADN transformant. On calcule la quantité pour 1 µg.

5 5/ a) Le nombre de cellules viables est calculé à partir de la souche non transformée, N= ( )/2 x 10 4 x10= 3,25 x 10 7 UFC/ml. Nombre de transformants = 2.7 x 10 6 UFC/ml. b) Efficacité de transformation est le nombre de transformants/ µg d ADN. C/C : L ADN double brin est nécessaire à la transformation car c est l énergie de dégradation de l un des brins qui maintient l état de compétence et le transport du brin non dégradé vers le cytoplasme.le plasmide linéaire a une efficacité de transformation très faible ou nulle. Ceci est dû à la présence chez E. coli de l exonuclése V qui dégrade l ADN ds linéaire. Pour inactiver l exo, on peut travailler dansune souche recb recc. 6/ 7/ a) Marqueur de sélection : leu+, marqueur de contre-sélection : Streptomycine. b) Le génotype des colonies roses sur MacKonkey est mal +, car les bactéries qui sont capables de fermenter le maltose vont acidifier le milieu et provoquer une précipitation des sels biliaires qui se trouvent dans le milieu. Les colonies blanches n ont pas pu fermenter le maltose (mal - ). Les colonies bleues sur X-gal, sont lac +, les blanches sont lac-. c) ordre des gènes : leu, mal, pro, lac (faire les calcul en %). a) ration F-/Hfr : 4x10 8 /2x10 7 = 20. Si on inverse le ratio, on provoque une agrégation des cellules et la lyse. b) Streptomycine. c) (leu, thr) d) ordre : (leu, thr), ten, lac, gal,(mal,xyl). 8/ On introduit F Lac dans une souche E. coli Lac -. On effectue ensuite une culture à la température permessive de 30 C dans un milieu minimum contenant le lactose comme source de carbone. On fait un schift à haute température. F Lac ne peut se répliquer de manière autonome. Pour survivre, les bactéries doivent intégrer F le plus probable au niveau de la région lac. Si la souche a une délétion au niveau de la région d homologie, F s intègre au hasard (présence de séquence IS). 9/ a) moi=0.1 pour éviter que chaque bactérie ne soit infecter simultanément par deux phages. Le trisodium citrate est un chélateur des ions Ca2+, nécessaires à l adsorption du phage sur la bactérie, on évite ainsi une réinfection des bactéries par les phages libérés. b) fréquence de cotransduction hupa -, mal + : 13/50 (0.26) Fréquence de cotransduction hupa-, leu + : 23/50 (0.46). c) L ordre des gènes est hupa-leu-mal car la fréquence de cotransduction de mal est inferieure à celle de leu donc mal est le plus distal des gènes. Si la fréquence est égale ex : leu (0.46), mal (0.48), ça veut dire que le gène hupa est flanqué de part et d autre par leu et mal (mal-hupa-leu). 10/

6 Chaque Hfr transfère ses marqueurs à partir d un point fixe et dans un ordre bien déterminé. QWDMTPXACNBQ. 11/ 87-99% des prototrophes ont les marqueurs rpsl et mal appropriés à la souche F -. Donc on a une polarité pour le transfert de l ADN de la souche donatrice F + vers la souche réceptrice F -.