Plateau technique Imagerie cellulaire IFR141 ITFM. Responsable Scientifique : Pr C. Poüs Responsable du service : Valérie Nicolas

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1 Plateau technique Imagerie cellulaire IFR141 ITFM Responsable Scientifique : Pr C. Poüs Responsable du service : Valérie Nicolas

2 «Principe de la microscopie confocale à balayage laser» Formation permanente INSERM 15 au 19 Janvier 2007 Valérie Nicolas IFR141- ITFM

3 Microscope confocal à balayage laser (LSM 510 Zeiss - META)

4 I- Microscopie confocale à balayage laser : A- Pourquoi confocal B- Résolutions spatiales, rôle du pinhole C- Le principe de la microscopie à balayage laser D- Les coupes optiques Le plan II- Du laser à l image numérique : A- Les lasers B- AOTF / AOBS (Syst. de Sélection / Réglage d intensité des raies laser) C- La tête confocale D- Les miroirs de balayage E- Le pinhole F- Les photomultiplicateurs G- L image numérique H- Les règles d échantillonnage I- Le rapport signal sur bruit

5 I - Microscopie confocale à balayage laser Le principe

6 Microscope à épifluorescence Microscope confocal Cardiomyocyte néonatal de rat

7 Pourquoi Confocal? Pinhole Illumination Echantillon Pinhole Détection Condenseur Objectif Principe de la microscopie confocale selon Marvin Minsky 1957

8 Microscopie confocale : Le principe Pinhole

9 L élément important : le pinhole (trou d aiguille) 1 er mot clé

10 Résolution d un système optique Conventionnel Confocal d xy = 0,61.λ em /(n sinα) d xz = 2.nλ em /(n sinα) 2 d xy = 0,46.λ em /(n sinα) d xz = 1,4.nλ em /(n sinα) 2 (+1 à 15%) (+30%) François Waharte - IBL/ICF

11 La résolution spatiale Résolution x, y ( 1-15% meilleure qu'en fluorescence non confocale ) Résolution z ( 30 % meilleure qu'en fluorescence non confocale ) rx 0.46 ON λ = X,Y Exemple : à 500 nm Objectif 63X, 1.4 ON (immersion oil ) rz λ 1,4n = ON² X,Z Résolution X, Y : 160 nm Résolution X, Z : 500 nm

12 Microscopie confocale Laser continu HeNe 543 nm Laser Pulsé fs NdYLF 1047 nm Double cône de lumière Un point focal Monophoton Deux photons

13 Microscopie confocale : Le principe Pinhole

14 Détecteur de photons Pinhole Miroir dichroïque Source lumineuse Objectif Plan focal Double cône de lumière

15 Détecteur de photons Détecteur de photons Pinhole Source lumineuse Miroir dichroïque Source lumineuse Miroir dichroïque Objectif Objectif Plan focal Plan focal

16 Formation d une image - Balayage Excitation laser 488nm (bleu) Emission fluorescence verte Y 480 pixels François Waharte - IBL/ICF X 512 pixels

17 Microscopie confocale : Acquisition des images François Waharte - IBL/ICF

18 Microscopie confocale : Acquisition des images #1 #2 #3 Z #1 #2 #3 #4 #5 #6 #4 #5 #6 2 ième mot clé Coupes optiques ou Z stack

19 Cellules Wif B Immunomarquage ZO1 (jonctions serrées) DPP IV (pôle apical) Deux canalicules biliaires Doris Cassio U442 INSERM

20 Wif-B DPP IV ZO-1 Coupes optiques dans l épaisseur de l échantillon 63X /ON 1.4 huile Coupes optiques : 0.8µm Pas : 0.4 µm

21 Wif-B DPP IV Ex : Laser 488nm Em : BP nm ZO-1 Ex : Laser 543 nm Em: LP 560 nm 63X /ON 1.4 huile Coupes optiques : 0.8µm Pas : 0.4 µm

22 Projection

23 Visualisation 3D 12 images / sec

24 4D imaging: 3D + time Plan 1 Plan 2... Plan 1 Plan 2... Plan 1 Plan 2... Axe Z T=0 Plan 8 Plan 9 Axe Z T=15 Plan 8 Plan 9 Axe Z T=30 Plan 8 Plan 9 François Waharte - IBL/ICF

25 LES CELLULES CACO-2 Issues d un adénocarcinome colique humain Différenciation spontanée à la confluence phénotype d entérocyte Expriment la plupart des hydrolases Bon modèle d étude des modifications fonctionnelles induites par les Rotavirus Unité INSERM 510 / Sandra Martin

26 Vue orthogonale Représentation orthogonale Selon l Axe 2 Axe 2 Représentation orthogonale Selon l Axe 1 Axe 1 Cellules épithéliales polarisées (Caco 2)

27 COUPES XZ Cellules épithéliales intestinales humaines (Caco-2) en culture (25 jours après confluence) sur filtre (Transwel). Les cellules sont traitées avec le TNF (10 ng/ml). A- Marquage de l actine avec la phalloidinerhodamine (en rouge) B- Marquage apical de Pgp (P-glycoprotéine) avec l utilisation d un anticorps secondaire conjugué à un AlexaFluor 488 (en vert). C- Superposition des deux marquages. D- Image A en négatif. Il s agit de coupes xz réalisées dans l épaisseur de la couche cellulaire grâce à une ligne de scan Ces cellules polarisées ont ici une hauteur de 30 µm.

28 Visualisation : DIC ou Nomarski

29 II- Du laser à l image numérique Les différents éléments de la microscopie confocale Les Lasers L AOTF /AOBS La tête confocale Miroirs de balayage Le pinhole Le photomultiplicateur L image numérique

30 Microscopie confocale : Le principe

31 Mise en place d une configuration Exemple : FITC Filtre d émission LP 505 nm Miroir dichroïque Laser 488 nm Echantillon DIC

32 Microscopie confocale : Le principe

33 Les lasers : light amplification by stimulated emission of radiation Amplification de Lumière par Emission Stimulée Lasers (lumière monochromatique) Plateau technique IFR141 Argon 25 mw 457nm - 488nm - 514nm Argon 100 mw 351nm - 361nm - 488nm - 514nm HeNe 543 nm HeNe 633 nm Kr/Ar 488 nm nm nm He/Cd 422 nm Diodes laser (405, 408, 440, 635, 640, 660, 685, 780, 785,830 nm) Rayonnement cohérent dans l espace et dans le temps

34 Laser : une longueur d onde _ Lumière cohérente

35 Les lasers : light amplification by stimulated emission of radiation Amplification de Lumière par Emission Stimulée Tube laser Miroir réfléchissant Miroir semi-transparent Faisceau laser Le principe du laser consiste à exciter les électrons d'un milieu, puis à y déclencher l'émission de photons en cascade, et à accumuler le rayonnement entre deux surfaces réfléchissantes avant de le relâcher sous forme de rayon

36 AOTF Acousto Optical Tunable Filter Absorbeur acoustique Rayon ordre 0 CristalTeO2 Transducteur acoustique Source fréquences Radio variables ( MHz) = sélection λ (700nm-400nm) Puissance ( 0.5-3W)= intensité Système de déflection de raies spectrales

37 AOTF Acousto Optical Tunable Filter

38 AOBS Acousto-optical Beam splitter

39 AOBS Acousto-optical Beam splitter Courbes de transmission En Bleu: triple dichroïque, bleu, vert, rouge En Rouge: AOBS 488, 543, 633 nm

40 Laser Hélium-Néon I Fibre optique Laser Hélium-Néon II Laser Argon Banc laser

41 Tête confocale Fibre optique LSM 510 ZEISS

42 Microscopie confocale : Architecture du LSM 510 Trajet optique de la tête de balayage PMT Filtre d' émission Pinhole Fibre Optique Beam Splitter Scanners X&Y

43 Microscopie confocale : Architecture du SP2, Leica Trajet optique de la tête de balayage

44 Microscopie confocale : Architecture du SP2, Leica

45 Microscopie confocale : Architecture du SP2, Leica Canal vert Canal bleu Prisme Pinhole Canal rouge Détail : fente variable Détail de la tête confocale

46 Microscopie confocale : Acquisition des images Scanning Scanner Y Laser Y Scanner X X

47 Le zoom électronique Miroirs de balayage Laser Image de 512 X 512 Exemple : Zoom 1 = champ de 146 µm X 146 µm Zoom 2 = champ de 73.1µm X 73.1 µm

48 Microscopie confocale : Le principe Pinhole

49 L élément important : le pinhole (trou d épingle)

50 Photomultiplicateur Microscopie confocale : Le principe

51 Détecteur de photons : Photomultiplicateur

52 Photomultiplicateurs sur les microscopes Leica SP Hamamatsu Photomultipliers Red/White R6358 first channel R Cathode radiant sensitivity (maw) Quantum efficiency(%) La sensibilité de l oeil Wavelength (nm)

53 Acquisition des images PMT (photomultiplicateur) D un photon à une avalanche d électrons Fluorescence photons e - François Waharte - IBL/ICF Gain (V) Amplification Signal analogique Numérisation (image)

54 Acquisition spectrale Photomultiplicateur Multianodes 32 canaux de détection 10.7 nm X 32 Système META, Zeiss

55 Module META (Détection spectale) Imagerie en multifluorescence - Acquisition de plusieurs signaux simultanément (FPs etc.) jusqu à 8 marqueurs - Séparation propre de composés fluorescents sans risque de crosstalk - Imagerie Quantitative en fluorescence (colocalisation) - Suivi de modifications de spectres en dynamique (FRET, ion indicators, Kaede) rouge de nile bleu de Nile UMR Physico-Chimie des systèmes, polyphasés- Mr Ollivon, Hela Gliguem

56 Microscopie confocale : Acquisition des images PMT Objectif Photons Signal analogique (U en V) C.A.N. Signal numérique (NG codé sur 8,12 bit) RAM Ecran, DD.

57 Qu est-ce qu une image numérique? Un tableau de nombres Cases = Pixels (Picture Element) ou Voxels en 3D Valeurs = Niveaux de Gris (NG) = intensité lumineuse Chaque pixel est codé en bit (binary digit) En général codés sur 8 bits soit 2 8 =256 niveaux de gris allant du noir absolu au blanc parfait.

58 Formation d une image numérique 0 29 Pixel Y 480 numerisation François Waharte - IBL/ICF X 512 pixel : picture element

59 Pixels Bleus = zéro fluorescence Pixels Rouges = saturation Règlage de la dynamique Utilisation d une LUT (Look Up Table) 256 niveaux de gris = Image 8 bit 4096 niveaux de gris = Image 12 bit niveaux de gris = Image 16 bit Range Indicator Glow scale Rainbow

60 Règlage de la dynamique Utilisation d une LUT (Look Up Table) Sensibilité du détecteur Gain Saturation de fluorescence Offset Zéro fluorescence

61 Qu est-ce qu une image numérique? Taille (pixels) 512 X bit 1024 X bit 2048 X bit Dimension L : 8.67 cm H : 8.67 cm L : cm H : cm L : cm H : cm Résolution 150 pixels/pouce 150 pixels/pouce 150 pixels/pouce Taille (octets) 257 Ko 1 Mo 4 Mo Avec Adobe Photoshop, allez dans «image» puis «taille de l image»

62 3ième mot clé Régle d échantillonnage Résolution de l appareil / Taille du pixel

63 Microscopie confocale : Résolution Résolution x, y ( meilleure qu'en fluorescence non confocale ) Résolution z (dépend du carré de l Ouverture Numérique) rx rz = 0.46 ON λ λ 1,4n = ON² X,Y X,Z Exemple : Objectif 63X, 1.4 ON (immersion oil ) Résolution X, Y : 200 nm Résolution X, Z : 500 nm

64 Règle d échantillonnage bidimensionnelle (x,y) IF 1 Signal analogique de deux points à résoudre 0.5 NYQUIST Taille r/2.3 Taille r x pixels pixels Dans l idéal le pas d échantillonnage devrait être r /2.3 Exemple : obj.63x, NA 1.4 Résolution : nm Taille du pixel : nm

65 Choisir la bonne taille de pixel 800 x 800 nm 400 x 400 nm 200 x 200 nm 100 x 100 nm François Waharte - IBL/ICF

66 Taille du pixel et zoom électronique Objectifs Longueur d onde (Émission nm) ON Résolution xy (µm) Taille du pixel r/2.3 (µm) Zoom optimal 512X X X X X 2 X 1 X 40 X X 3 X 1.5 X 20 X X 3 X 1.7 X 10 X X 2.8 X 1.4 X

67 Echantillonnage en Z Coupe 1 Coupe 2 Epaisseur de la coupe optique Canal 2 Epaisseur de la coupe optique Canal 1 Pas de l objectif 0.30 µm

68 Echantillonnage en Z Epaisseur des coupes optiques : 0. 8µm Pas : 0.4 µm le diamètre du pinhole déplacement de l objectif en Z

69 Projection

70 Visualisation 3D 12 images / sec

71 Le rapport signal sur bruit

72 Rapport signal sur bruit Pixel time 1.28s Moyennage 1 Pixel time 3.20 s Moyennage 1 Pixel time 3.20 s Moyennage 4

73 Rapport signal sur bruit Vitesse de scan Pixel time (s) Moyennage

74 Conclusion - Obtenir des images de la localisation de protéines /autres molécules à l aide de marqueurs fluorescents, en réalisant des séries de coupes optiques dans l épaisseur de l échantillon Multimarquage / Colocalisation - Rôle essentiel du pinhole (diaphragme de détection) Résolution xy : amélioration de 1_15 % /microscopie conventionnelle Résolution en Z : amélioration de 30% / coupes optiques / 3D - Suivi de processus dynamiques : GFP/ lasers / F-techniques Time lapse 2D +temps; 4D (3D+temps) - Image numérique : Quantification, reconstruction 3D, tracking

75 FIN Valérie Nicolas IFR141- ITFM