Microscopie confocale

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1 Microscopie confocale FP CNRS Nice 2009 Christian Rouvière CNRS-UMR7009

2 Microscopie confocale Microscopie de fluorescence Principe incidence de la microscopie photonique sur la MC Les modes d acquisition Contraintes Lasers

3

4 CLSM Confocal Laser Scanning Microscope

5 Microscopie confocale

6 pinholes confocaux Laser Principe Détecteur Dichroique A D B E Ph Objectif C S O Objet : dans le plan focal Shinya Inoué 1984, Hanbook of biological confocal microscopy : Fondations of confocal scanned imaging in light microscopy

7 Nombre de publications Tendances Medline tendances Medline confocal 2phot multi phot image microscopy Années

8 Particularités des images acquises en MC Balayage Coupe optique

9 air Immersion n 1 eau n 2 n 1 <n 2 image compressée

10 huile Immersion n 1 eau n 2 n 1 >n 2 image étirée

11 La résolution : Définitions La limite de résolution d'un instrument d'optique est la dimension du détail le plus petit observable avec l'instrument. La limite de résolution intrinsèque de l'instrument est une limite absolue : Elle ne dépend que de l'objectif Elle est due au phénomène de diffraction de la lumière par l'objectif

12 Résolution : critère de Rayleigh 1 RESEL

13 Résolution : Calcul R latérale = 0.61 l / NA R axial = 1,4 n l / NA 2 NA = n sinq n NA q res

14 Ouverture Numérique (NA) Limite de résolution de l objectif Limite du grossissement commercial La profondeur de champ

15 La résolution numérisation d une image en microscopie optique dépend du champ du microscope Obj/ NA d(mm) l(540nm) D(mm) Pixels (champ de 20 mm) 5x/ x/ x/ x/ x/1.3 oil x/1.40 oil x/1.3 oil mm

16 Brillance des objectifs x x x x x x x x x x x x Brightness = fn (NA 4 / magnification 2 )

17 Résolution en microscopie confocale 0.18 mm 0.59 mm

18 Caractéristiques des lamelles nombre épaisseur mm mm mm mm mm Tolérance : +/-0.01 pour NA >0.7 +/-0.03 pour 0.3<NA <0.7

19 Comment lire un objectif de microscope L 2 s 2 = n sinq s 1 q L 1 1/s 1 + 1/s 2 = 1/f

20 Code des couleurs Immersion Grossissement Huile Eau Glycérol Multi

21 Acquisitions en MC XY XYZ XZ XYZl XYZ reconstruction 3D XYt

22 Acquisitions en MC XY XYZ XZ XYZl XYZ reconstruction 3D XYt

23 Acquisitions en MC XY XYZ XZ XYZl XYZ reconstruction 3D XYt

24 Acquisitions en MC XY XYZ XZ XYZl XYZ reconstruction 3D XYt

25 Acquisitions en MC XY XYZ XZ XYZl XYZ reconstruction 3D XYt

26 XYt 32 lignes (512X512) dans le myoplasme Rémi Dumollard

27 Imagerie rapide : Vagues Calciques 1 img/37ms d Moyenne verticale t Rémi Dumollard

28 Microscopie confocale de réflexion

29 Montage classique

30

31 Cross-talk correction DAPI-FITC emission FITC-TRITC emission

32 Alternative : Balayage simultané

33 Séparation spectrale Acquisition des Stacks l Définition des spectres de référence Séparation spectrale des données brutes

34 Séparation spectrale Acquisition d un stack Echantillon Lambda Stack

35 Séparation spectrale Acquisition d un spectre de référence A : échantillon B : stack C : projections codées avec des régions d intérêt D : Signatures spectrales des sondes

36 Séparation spectrale Acquisition de spectres de référence d un échantillon contenant des cibles spatialement superposées Échantillon et 3 références Stacks projections codées avec des régions d intérêt Signatures spectrales des sondes

37 Séparation spectrale

38

39 Lasers : Dommages corporels Class I Ne produisent pas de risques Class II Ne produisent généralement pas de risques sauf s ils sont regardés directement de face Class IIIa Class IIIb Class IV Produisent des lésions s'ils sont regardés au travers de collecteurs Produisent des lésions s ils sont regardés directement ainsi que leurs réflexions Produisent des lésions et brûlures de la peau en s interposant dans son trajet ou même ses réflexions

40 Les choix techniques des fabricants AOBS/AOTF Double balayage Lumière structurée Acquisition confocale rapide Spinning disc ou disques de Nipkow Balayage par miroir résonant Balayage d une fente Balayage d une grille de pinhole TIRF Autre techniques évoluées Bi photon 4 P STED PALM Déconvolution

41 Système AOBS Acousto Optical Beam Splitter

42 Acousto-Optical Beam Splitters

43 Systèmes à deux têtes de balayage

44 SIM Scanner Second scanner dedicated for laser light stimulation, synchronized to the FV1000 main scanner for simultaneous laser stimulation and confocal image acquisition.

45

46 Systèmes à lumière structurée Apotome Optigrid

47 Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope M. A. A. Neil, R. Juˇskaitis, and T. Wilson December 15, 1997 / Vol. 22, No. 24 / OPTICS LETTERS Principe

48 Optigrid Apotome

49 Apotome/Optigrid A B C S1=A-B S2=A-C S3=B-C S=f(S1+S2+S3)

50 Optical Specifications Using a 100X 0.95 NA dry objective, 1X video coupler, 1300x1030 CCD b/w camera, 750 lp/in Grid Optical Section Thickness...0.4µm FWHM Magnification...100X Field-of-View mm x 0.22mm Acquisition Speed...up to 3 optical sections/sec (1300 x 1030 pixel frames) monochrome * Specifications cited above are configuration-dependent. Your performance may vary. Available Spectrum...Deep UV thru IR Imaging: Monitor...confocal and/or Video Eyepiece...Conventional Visual System Dimensions: Slider Module W x 1 H x 3.5 L Grid Amplifier...8 W x 3 H x 10 L Currently there are several standard OptiGrid packages that are off-the-shelf compatible with a range of state-of-the-art microscope brand models. You can choose from

51 Spinning disc ou disques de Nipkow

52 Microscope confocal à disque Nipkow

53 Scanning & detection UltraVIEW Pinhole 20,000 pinhole apertures in a multi-lens-enhanced Nipkow disk assembly Detector Detector module, comprised of detector head, mounted directly on to the confocal scanner, digital controller and interface to the computer workstation. Hamamatsu ORCA ER Firewire cooled CCD detector MHz readout Quantum Efficiency at 500 nm = 70% Scan Frame Size 1344 x 1024 (at 12-bit) Scanning and Acquisition Speeds Scanning speed: 360 frames per sec (fps) Image acquisition speed: 0.1 to 20fps

54 Série temporelle acquise avec un microscope confocal à disque de Nipkow Alex McDougall : œuf (Ascidiela Aspersa) injecté avec Ca-Green mmol puis observé 10minutes après fécondation.

55 Balayage résonant Visitech Leica

56 Microscope confocal à Balayage résonant

57 Balayage d une fente LSM 5 LIVE

58 Balayage d une grille de pinhole

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