Compléments de Biologie Moléculaire et Cellulaire. 1 année de Licence

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1 Compléments de Biologie Moléculaire et Cellulaire 1 année de Licence Annexes des cours de biologie moléculaire et cellulaire afin de parfaire leur compréhension. Par Chringel 2011

2 LA MICROSCOPIE SOMMAIRE La Microscopie... 3 Principe... 3 Notions liées à la Microscopie... 3 La Transmission... 3 Le Pouvoir Séparateur... 3 Profondeur de Champ... 4 Grossissement... 4 La Microscopie Photonique ou Optique à Transmission... 4 Principe... 4 Les Différents Types de Microscopie Photonique... 5 Microscopie à Fond Clair... 5 Microscopie à Fond Noir... 5 Microscopie à Contraste de Phase... 5 Microscopie à Fluorescence... 5 Microscopie Confocale... 6 Préparation des Echantillons... 7 Microscopie Electronique à Transmission... 7 Principe... 7 Visualisation des Structures... 7 Préparations Spécifiques... 8 Coloration Négative... 8 Ombrage Métallique... 8 Cryofracture... 8 Préparation des Echantillons... 9 Microscopie Electronique à Balayage... 9 d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 2

3 La microscopie désigne l ensemble des techniques permettant l image de la structure biologique. On observe toujours du niveau macroscopique au niveau microscopique. LA MICROSCOPIE PRINCIPE Une onde envoyée sur la préparation ou émise par cette dernière est captée par un objectif qui la concentre puis, passe par un oculaire pour donner une image. NOTIONS LIEES A LA MICROSCOPIE LA TRANSMISSION L observation de l objet traversé par la lumière nécessite : Aucune structure massive Peu d échantillon sur les lames. LE POUVOIR SEPARATEUR Le Pouvoir Séparateur définit et caractérise la puissance du microscope. Le pouvoir séparateur est la distance minimale entre deux éléments d un objet qui permet d en obtenir deux images séparées. Le pouvoir séparateur correspond à la limite de détection. Cette limite varie selon la technique employée : Limite de l œil : 0.1mm Limite de la microscopie optique ou photonique : 0.1µm Limite de la microscopie électronique : 0.1nm On le calcule grâce à la loi d Abbé. LOI GENERALE D ABBE: d= (0.61 x λ) / (n x sin u) d : pouvoir séparateur λ : longueur d onde de la source lumineuse n : indice de réfraction u : ouverture mécanique Plus le pouvoir séparateur est petit est plus la résolution est bonne et le microscope sera puissant. Donc, si la longueur d onde est faible et l ouverture mécanique grande, alors le pouvoir séparateur sera grand. COMMET AUGMENTER LA RESOLUTION OU DIMINUER LE POUVOIR SEPARATEUR? diminuer λ : utilisation de filtres bleu λ=0.4nm augmenter n : utilisation d huile n=1.5 c est l observation à l immersion augmenter u : utilisation d objectif à grand angle. d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 3

4 PROFONDEUR DE CHAMP La profondeur de champ correspond à l épaisseur de l objet qui donne l information dans l image résultante. Celle-ci doit être la plus petite possible et dépend de l ouverture numérique : plus l ouverture numérique est grande et plus la profondeur de champ est faible. Par exemple : obj x10 profondeur de champ 25µm obj x100 profondeur de champ 1µm GROSSISSEMENT Le grossissement est le grandissement de l objectif multiplié par le grossissement de l oculaire. Par exemple : obj x40 avec ocu x10 grossissement = 40 x 10 = 400 LA MICROSCOPIE PHOTONIQUE OU OPTIQUE A TRANSMISSION PRINCIPE Le principe de la Microscopie Photonique à Transmission est contenu dans le nom : Photonique: utilisation de la lumière donc des photons. A transmission: lumière transmise par l échantillon donc elle traverse l échantillon. d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 4

5 LES DIFFERENTS TYPES DE MICROSCOPIE PHOTONIQUE MICROSCOPIE A FOND CLAIR Microscopie classique La lumièr e passe directement à travers l échantillon On obtient une image peu contrastée, le colorant est donc souvent utilisé en complément. MICROSCOPIE A FOND NOIR La lumière passe à travers l échantillon en oblique Les zones ne diffusant pas la lumière sont noires et les zones diffusant la lumière sont blanches On obtient une image lumineuse sur fond noir Cette microscopie est utilisée pour l observation d objets à l état frais sans coloration. MICROSCOPIE A CONTRASTE DE PHASE Il y a un système de canalisation de la lumière par un diaphragme ce qui permet de transformer les différents indices des milieux traversés par la lumière en différents niveaux d amplitude lumineuse. On obtient une image en dégradé de gris Cette microscopie est très utilisée en biologie cellulaire. MICROSCOPIE A FLUORESCENCE Correspond à la microscopie électronique à épi fluorescence Utilisation obligatoire de fluorochrome d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 5

6 On éclaire uniquement les structures qui nous intéressent : o On couple les fluorochromes avec des anticorps venant se fixer sur la partie que l on souhaite observer o On attend un peu puis on observe la partie souhaitée maintenant fluorescente Fluorochrome : molécule qui, excitée par une lumière UV réémet une lumière dans le visible. MICROSCOPIE CONFOCALE Même principe que la microscopie à fluorescence La lampe UV est remplacée par un laser UV qui permet de mieux focaliser la lumière. On obtient ainsi un faisceau de lumière très fin qui peut être déplacé le long et dans l épaisseur de l échantillon. On réalise une coupe optique par balayage de l échantillon. o On éclaire les fluorochromes par le côté avec le laser UV o On prend une photo. o On monte sur l axe Oz (haut) de quelques µm avec le laser. o On éclaire à nouveau les fluorochromes avant de prendre une photo. o Une fois que tout l échantillon a été parcouru, on assemble les photos prises et on obtient alors une image précise de l échantillon. d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 6

7 PREPARATION DES ECHANTILLONS 1. Prélèvement de l échantillon 2. Fixation On arrête toute vie cellulaire, on fige et consolide l objet comme un arrêt sur image en le plongeant dans l azote ou un liquide. 3. Déshydratation On enlève l eau de l objet et on la remplace par un solvant de la paraffine : le toluène. Comme le toluène n est pas soluble dans l eau, on remplace d abord l eau par de l éthanol avant de remplacer l éthanol par le toluène. 4. Inclusion On plonge l échantillon dans de la paraffine fondue. On passe ensuite ce mélange au four avant de mettre la paraffine avec l échantillon à refroidir dans un moule. 5. Coupe au microtome On réalise des coupes de l ordre du µm en ruban grâce au microtome. 6. Etalement et Collage des Coupes sur une lame 7. Déparaffinage On enlève la paraffine en plongeant la lame dans le toluène puis dans l éthanol puis dans l eau. 8. Coloration (si nécessaire) 9. Déshydratation 10. Montage et Observation des lames MICROSCOPIE ELECTRONIQUE A TRANSMISSION PRINCIPE Le faisceau de photons utilisé en microscopie photonique est remplacé par un faisceau d électrons dont la vitesse peut être accélérée sous vide. Du fait de la suppression des photons, il n y a plus de longueur d onde λ pour entrer dans la loi d Abbé : le pouvoir séparateur d est donc faible. VISUALISATION DES STRUCTURES La couleur de visualisation va changer selon le niveau d énergie des électrons arrivant dessus : Energie maximale = excitation maximale : l électron laisse une tâche blanche Energie plus faible = excitation plus faible : l électron laisse une tâche grise On obtient alors une image en noir et blanc. L image obtenue peut aussi apparaître noire et blanche si on utilise des contrastants. d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 7

8 PREPARATIONS SPECIFIQUES COLORATION NEGATIVE Dépôt de métaux lourds sur la coupe posée sur un film transparent. On obtient alors une image inverse : o Si l électron passe : image blanche o Si l électron est stoppé : image noire OMBRAGE METALLIQUE Pulvérisation de métaux opaques selon un angle donné On obtient une image avec un effet de 3D. CRYOFRACTURE On obtient une image de cellule comme en feuillets. Principe : o Congélation rapide de l échantillon à -160 C dans de l azote ou du fréon liquide. o Fracture de l échantillon avec un couteau froid suivant les plans de moindre résistance. o Décapage des surfaces. o Ombrage métallique avec du carbone afin de confectionner une réplique. d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 8

9 PREPARATION DES ECHANTILLONS 1. Prélèvement de l échantillon 2. Fixation On utilise uniquement la fixation chimique grâce au formol. 3. Dessiccation On dessèche l échantillon au lieu de le déshydrater. 4. Inclusion On plonge l échantillon dans de la résine fondue. On passe ensuite ce mélange au four avant de mettre la résine avec l échantillon à refroidir dans un moule. On utilise de la résine au lieu de la paraffine car elle est plus dure. 5. Coupe au microtome On réalise des coupes de l ordre de 50 à 90 nm en ruban grâce au microtome. 6. Etalement et Collage des Coupes sur une lame 7. Dérésinage On enlève la résine. 8. Montage et Observation des lames Il n y a pas de coloration ni de déshydratation lors de la préparation des lames observées au microscope électronique. De plus, on ne peut pas observer d êtres vivants car l observation se déroule sous vide (en quelque sorte). MICROSCOPIE ELECTRONIQUE A BALAYAGE Le principe est un peu semblable à celui utilisé par la microscopie électronique à transmission. On bombarde d électrons l échantillon à observer. Cet échantillon est placé sous une cloche recouverte de capteurs reliés à un ordinateur. Suite à une analyse de l ordinateur, l objet est reconstitué de façon précise avec une apparence 3D. d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 9

10 TECHNIQUES DE LOCALISATION ET DE SEPARATION DES ORGANITES ET MACROMOLECULES EN BIOLOGIE CELLULAIRE SOMMAIRE Cytochimie Colorants Vitaux Colorants Spécifiques Coloration de Feulgen Coloration Acide Périodique et Réactif de Schiff ou APS Immunocytochimie Anticorps Immunofluorescence Immunofluorescence Directe Immunofluorescence Indirecte Autre Marquage Cytoenzymologie Radioisotopes Définition Pulse Chase Autoradiographie Tris Cellulaire : Cytométrie en Flux Fractionnement des Cellules, Séparation des Organites Coefficient de Sédimentation En fonction de la Vitesse de Sédimentation Centrifugation Différentielle d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 10

11 Centrifugation Zonale En fonction de la Densité Centrifugation Isopycnique ou à l Equilibre d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 11

12 CYTOCHIMIE COLORANTS VITAUX Ils permettent la mise en évidence des constituants cellulaires. Les colorants vitaux permettent des colorations réalisées sur du matériel vivant grâce à des colorants non toxiques, basiques. En voici quelques uns : Bleu de Toluidine : colore les composés acides tel l ADN en bleu. Rouge Neutre : indicateur du ph permettant de différencier les cellules mortes des cellules vivantes selon son relargage. o Rouge : forme acide o Zone de virage : ph 8 à 8.8 o Jaune orangé : forme basique Bleu de Coomassie : colore les protéines présentes dans un gel ou une cellule. Il est spécifique aux protéines : il reconnait la forme d une protéine, il localise donc toutes les protéines présentes sans distinction. Vert de Méthyl : colore l ADN en vert. Vert de Janus: colore les mitochondries en vert. COLORANTS SPECIFIQUES COLORATION DE FEULGEN La coloration de Feulgen permet la localisation directe de l ADN qui est alors coloré en rouge. Cette réaction correspond à la coloration par le réactif de Schiff (fuschine décolorée par oxyddation) des acides désoxyribonucléiques après une hydrolyse ménagée par l HCl. En effet : un traitement à l HCl à 60 hydrolyse les bases puriques A et G. Le réactif de Schiff se fixe alors sur les fonctions aldéhydes et forme un précipité rouge. PROTOCOLE: Incuber les racines d Oignon fixées en éthanol dans de l HCl 5N durant 20 minutes Rincer avec de l eau Incuber avec du réactif de Schiff durant 15 à 20 minutes Ecraser délicatement dans une goutte d eau sur une lame Monter une lamelle et observer au microscope d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 12

13 COLORATION ACIDE PERIODIQUE ET REACTIF DE SCHIFF OU APS La coloration APS permet de colorer de façon spécifique les polysaccharides en rouge. Elle va donc colorer par exemple le glycogène pour les cellules animales et l amidon pour les cellules végétales. Cette réaction correspond à la coloration par le réactif de Schiff des molécules de glucose présentes dans ces macromolécules, après hydrolyse par l acide périodique. Cette dernière permet de présenter des fonctions aldéhydes, reconnues par le réactif de Schiff, qui réagit en formant un précipité rouge. Lorsque l on utilise la microscopie électronique, on utilise le Thiocarbohydrate au lieu du réactif de Schiff. Il y a alors réduction de proléinate d argent qui est opaque aux électrons. PROTOCOLE: Incuber les racines d Oignon fixées en éthanol dans de l acide périodique 1% durant 20 minutes Rincer avec de l eau Incuber avec du réactif de Schiff durant 15 à 20 minutes Ecraser délicatement dans une goutte d eau sur une lame Monter une lamelle et observer au microscope IMMUNOCYTOCHIMIE ANTICORPS On peut localiser des macromolécules dans des structures cellulaires à l aide d anticorps dirigés contre ces molécules. STRUCTURE D UN ANTICORPS Un anticorps est composé de : 2 chaînes lourdes : 3-4 domaines constants et 1 domaine variable. 2 chaînes légères : 1 domaine constant et 1 domaine variable. La partie de l antigène reconnue par un anticorps s appelle l Epitope du déterminant génique. d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 13

14 IMMUNOFLUORESCENCE IMMUNOFLUORESCENCE DIRECTE Fixation de l échantillon Perméabilisation de l échantillon pour permettre l entrée d anticorps dans les cellules Incubation de l échantillon avec des anticorps anti-x couplés à des fluorochromes Anticorps se fixe sur la protéine X Lavage : élimination des anticorps non-fixés Montage de la lame Visualisation au microscope à fluorescence ou confocal IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE Fixation de l échantillon Perméabilisation de l échantillon pour permettre l entrée d anticorps dans les cellules Incubation avec des anticorps anti-x Anticorps se fixe sur la protéine X Lavage : élimination des anticorps non-fixés Incubation avec des anticorps secondaires anti-souris couplés à des fluorochromes d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 14

15 Montage de la lame Visualisation au microscope à fluorescence ou confocal Cette technique, contrairement à l immunofluorescence directe, permet d augmenter le signal émis par les structures visualisées. AUTRE MARQUAGE Le fluorochrome peut être remplacé par : Une enzyme : microscopie à fond clair Une bille d or colloïdale : microscopie électronique CYTOENZYMOLOGIE La Cytoenzymologie est l ensemble des techniques permettant de localiser in situ des réactions enzymatiques spécifiques. Une Enzyme est une protéine ou un ARN qui permet de catalyser une réaction métabolique. PRINCIPE Enzyme + Substrat < > Enzyme + Produit Ce sont des méthodes de détection des enzymes in situ qui les révèlent par leur activité et non pas par leur présence. La visualisation permet de préciser la localisation intracellulaire de l'enzyme: soit directement (oxydo-reductases), soit indirectement par coloration (hydrolases). d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 15

16 L expérimentateur fournit un substrat qui sera à l origine de l activité de l enzyme. Grâce à la mise en activité de celle-ci, on réussit à la repérer dans le milieu intracellulaire. Le substrat peut : Etre un perméant Donner un prduit coloré : changement de couleur entre le substrat et le produit Devenir insoluble : le produit formé va précipiter In situ : dans son milieu naturel RADIOISOTOPES DEFINITION Des Isotopes sont deux atomes ayant les mêmes propriétés chimiques, le même nombre d électrons mais un nombre de neutrons différent. Les isotopes sont dit lourds du fait de leur différente de masse. Certains isotopes sont instables ce qui entraîne une désintégration de la molécule: ce sont les isotopes radioactifs. TABLEAU DE ½ DES RADIOISOTOPES UTILISES EN BIOLOGIE Isotope Durée de ½ vie 131 I 8,1 jours 32 P 14 jours 35 S 87 jours 3 H 12,3 jours 14 C 5570 ans Ceux-ci sont utilisés pour marquer : L ADN Les os Les organes observés en médecine IRM Les acides aminés Etc. On parle alors de traceurs. L utilisation des précurseurs radioactifs en biologie permet de suivre la synthèse et le devenir des macromolécules. Nous nous intéressons aux molécules biologiques permettant de mieux comprendre le fonctionnement de la cellule, les précurseurs utilisés peuvent être : d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 16

17 Pour l ADN : la Thymidine radioactive Pour l ARN : l Uridine radioactive Pour les Protéines : un acide aminé souvent la Méthionine. PULSE CHASE On utilise l expérience de Pulse Chase ici pour déterminer comment se déroule la synthèse des protéines. 1. Un isotope radioactif 35 S est utilisé pour marquer les cellules. 2. On incube la culture cellulaire avec du 35 S pendant quelques minutes : c est le Pulse. 3. On les enlève ensuite du milieu pour les mettre dans un milieu contenant du S non radioactif avant d effectuer des prélèvements toutes les 10 minutes : c est le Chase. On a ainsi pu déterminer le transit d une protéine dans la cellule : Réticulum Endoplasmique Cys-Golgi Médian-Golgi Trans-Golgi Vésicule d exocytose AUTORADIOGRAPHIE Il existe plusieurs moyens de détection des radioisotopes : Compteur Geiger Compteur à scintillation Autoradiographie : d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 17

18 TRIS CELLULAIRE : CYTOMETRIE EN FLUX Il peut être nécessaire de trier des cellules pour analyser un type cellulaire particulier. Ce tri peut se faire par : Centrifugation différentielle Utilisation de caractères spécifiques des cellules que l on souhaite étudier Trieur cellulaire : cytométrie La cytométrie en flux permet l analyse de nombreux constituants cellulaires, d organites isolés (mitochondries, noyau), de certaines fonction cellulaires ou encore le comptage des cellules. PRINCIPE On marque les cellules à trier grâce à un marquage fluorescent. Les cellules fluorescentes vont être chargées positivement par l appareil. Un champ électrique va alors permettre de trier les cellules en fonction de leur charge. FRACTIONNEMENT DES CELLULES, SEPARATION DES ORGANITES Le fractionnement cellulaire consiste à décomposer les cellules de manière à isoler les principaux organites afin de pouvoir les étudier. La centrifugation permet de séparer des constituants de taille variable depuis des molécules jusqu au constituants cellulaires. Tous les constituants contenus sont soumis à la force de Gravité ainsi qu à la poussée d Archimède. En dehors du cas où les deux forces sont équilibrées (centrifugation isopycnique), on pourrait croire que les d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 18

19 constituants vont tomber au fond du récipient dans lequel ils se trouvent ou remonter à la surface. Cela arrive pour certain mais pour la majorité d entre eux, l agitation moléculaire empêche ce résultat. Elle n a pas de direction privilégiée et, à l échelle macroscopique, l agitation moléculaire est beaucoup plus importante que la force de Gravité ou la poussée d Archimède ce qui rend ses dernières négligeables. Les centrifugations se font en fonction de deux critères : la vitesse de sédimentation (donc la masse) ou la densité des particules. COEFFICIENT DE SEDIMENTATION Le coefficient de sédimentation v d une particule va être fonction de son volume, de la densité du solvant (détermine la poussée d Archimède), de l accélération et des frottements F. Il est mesuré et exprimé en Svedberg S qui correspondent à s. Plus sa valeur est élevée et plus la vitesse de sédimentation est importante. On peut accélérer ce processus en utilisant la centrifugation : on remplace alors la force de gravité par la force centrifuge. EN FONCTION DE LA VITESSE DE SEDIMENTATION CENTRIFUGATION DIFFERENTIELLE La centrifugation différentielle consiste en la rupture/broyage mécanique des cellules à étudier. On sépare les différents éléments à l aide de cycles de centrifugation croissante. Dans une première centrifugation à faible accélération, les éléments les plus massifs vont sédimenter et former un culot au fond du tube. Les éléments pour lesquels le temps de centrifugation a été trop court ou ceux dont l accélération a été trop faible pour contrebalancer l agitation moléculaire vont rester dans la fraction liquide appelée surnageant. Le surnageant et le culot sont récupérés séparément : les éléments les composants sont alors séparés. d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 19

20 On peut ensuite réaliser une seconde centrifugation avec une accélération moyenne avec le surnageant. On sépare ainsi progressivement les différents constituants en terminant par les éléments les plus petits et ayant le moins de différence avec la densité du solvant. Les fractions obtenues ne sont pas pures : elles sont enrichies. En effet, les échantillons initiaux sont souvent complexes. L intérêt de la centrifugation est de pouvoir traiter des échantillons très complexes sur des volumes important. CENTRIFUGATION ZONALE La centrifugation zonale consiste en la séparation des particules sur un gradient de densité préformé de saccharose en fonction de leur coefficient de sédimentation. Les différents éléments s accumulent entre les différents gradients de densité différente en fonction de leur densité. Les centrifugations différentielles et zonales correspondent à des sédimentations accélérées où la masse des particules à trier va être un paramètre prépondérant. Si la centrifugation est trop longue, les particules se retrouvent alors toutes dans le culot. EN FONCTION DE LA DENSITE CENTRIFUGATION ISOPYCNIQUE OU A L EQUILIBRE Lors d une centrifugation isopycnique, les particules sont séparées sur un gradient de densité non préformé au chlorure de césium en fonction de leur densité de flottaison quelles que soit leurs formes ou tailles. Cela permet la séparation d organites de taille similaire mais de densité différente. d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 20

21 Même avec une centrifugation trop longue, les particules s arrêtent de migrer une fois qu elles ont atteint leur niveau de flottaison. Cette méthode est assez précise pour séparer différents types de membranes ou des macromolécules marquées par un isotope différent d un même atome. d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 21

22 LA MITOSE CONTENU Etude de la Mitose Animale Etude de la Mitose Végétale d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 22

23 La Mitose correspond à la division cellulaire. Elle est présente chez l ensemble des espèces vivantes. ETUDE DE LA MITOSE ANIMALE INTERPHASE Réplication de l ADN Croissance et préparation à la mitose PROPHASE Condensation de la chromatine pour donner des chromosomes à deux chromatides Fragmentation du noyau (membrane nucléaire) Les centrioles ou centrosomes se placent chacun à un pôle de la cellule Alignement des microtubules MÉTAPHASE Alignement des chromosomes sur le plan équatorial/mitotique de la cellule Disparition du noyau Chaque chromatide de chaque chromosome est reliée à un pôle différent de la cellule par le centromère ANAPHASE Séparation de chaque chromatide des chromosomes Les chromatides sont tirés par le fuseau mitotique vers chaque pôle de la cellule TÉLOPHASE Les chromosomes à une chromatide se remettent vers la place du futur noyau Reformation du noyau Les microtubules lâchent les chromosomes Les composants cellulaires et organites reprennent leur place de façon équitable CYTODIÉRÈSE Elle se fait de l extérieur vers l intérieur à la manière d un goulet : c est la segmentation ETUDE DE LA MITOSE VEGETALE Les étapes sont les mêmes que chez la mitose animale exceptée pour quelques petits détails : Il n y a ni centriole ni aster lors de la mitose La séparation cellulaire lors de la cytodiérèse se fait de l extérieur vers l intérieur Il y a formation d une plaque cellulaire avec des vésicules de Golgi qui formeront la future paroi. Les microtubules formeront eux la future membrane plasmique. d'utilisation Commerciale - Partage à l'identique 2.0 France. Page 23

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