1ères rencontres d'oncologie Thoracique en Nouvelle-Aquitaine

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1 1ères rencontres d'oncologie Thoracique en Nouvelle-Aquitaine ADN circulant en ex-poitou-charentes L expérience de Poitiers Gaëlle TACHON 12 mai 2017 Laboratoire de Cancérologie Biologique Plateforme Hospitalière de Génétique Moléculaire des Cancers (INCa) Pr Karayan-Tapon Lucie

2 Prélèvement sanguin : plasma ADN Tumoral circulant PCR Digitale pour la recherche des mutations de l EGFr Sensibilité : 0.1% (screening de 3000 molécules = 10ng d ADN circulant) Au diagnostic [ADNc] > 10ng/µl [ADNc] < 10ng/µl Selon la quantité d ADN extrait A la Rechute Multiplex del exon 19 (12 génotypes) Exon 21 : p.l858r Exon 18: p.g719s Exon 20 : p.t790m Et la mutation activatrice si connue prélèvement tissulaire non réalisable bloc épuisé prélèvement tissulaire trop pauvre en cellules tumorales ADN extrait de la tumeur non amplifiable

3 Les choix technologiques de Poitiers Le Pré-analytique Appel du site préleveur et/ou du prescripteur au laboratoire Quantité de sang optimal à prélever : 15mL Sang du patient récupéré sur tube EDTA (conditionnement préféré) Acheminement dans les 3h au laboratoire de cancérologie biologique Ou Centrifugation du sang par un autre laboratoire dans un délai <3h post prélèvement isolation du plasma congélation à -20 C envoi à notre laboratoire à -20 C. Sang du patient récupéré sur tube Cell-Free DNA Collection Tubes (Roche) Tubes envoyés par le laboratoire aux sites préleveurs sur demande (si aucun accès à une centrifugeuse ) Acheminement au laboratoire de cancérologie biologique à température ambiante dans les 24h (possible envoi jusqu à 72h).

4 Les choix technologiques de Poitiers Analytique : Extraction choisie QIAamp DSP Circulating NA Kit (Qiagen) Avantages Technique simple. Coût modéré. Optimisée pour une extraction de 2.5mL de plasma. Extraction simultanée de plusieurs prélèvements possible. Contrôles d extractions positif et blancs réalisés en systématique. Dosage de l ADN

5 Les choix technologiques de Poitiers Analytique : la PCR digitale QX200 Droplet Digital PCR System (BIORAD) Technique allèle spécifique, quantitative, réputée très sensible Permettant la détection de mutation à %.

6 Les choix technologiques de Poitiers Technologie allèle spécifique Multiplexage possible Principe de la technologie Allèle non muté (Allèle X) Allèle muté WT (Allèle Y) C G Polymérase T A C Polymérase C G T A Fluorochrome bleu (VIC FAM ) Fluorochrome vert (FAM HEX ) Quencher

7 Les choix technologiques de Poitiers Amplification de l ADN Amplification de la fluorescence en fonction de l amorce fixée Lecture de la fluorescence gouttelette après gouttelette Traduction des résultats en graphe

8 L activité de Poitiers en quelques chiffres Recherche de mutations au niveau des exons 18, 19, 20 et 21 du gène EGFr : Séquence de référence NM_ Mutations recherchées si prise en charge au diagnostic: exon 19 :p.e746_a750del, p.l747_p753>s, p.l747_a750>p, p.l747_t751>p, p.e746_t751>i,p.l747_t751>q, p.e746_s752>d, p.l747_p753>q, p.l747_s752del, p.l747_e749del, p.l747_t751del, p.l747_t751>q exon 21 :p.l858r exon 18: p.g719s Mutations recherchées si prise en charge à la rechute: exon 20 : p.t790m +/- mutation activatrice initiale si quantité d ADN suffisant Exceptionnel et sur demande spécifique du clinicien : - Recherche de mutations au niveau des gènes KRAS ou BRAF. - Recherche de mutations EGFR au niveau du tissu tumoral, du LCR, épanchements

9 L activité de Poitiers en quelques chiffres Passage en routine en décembre 2015: Lettre au prescripteurs 2015: 3 analyses sur plasma 2016 : 102 analyses sur plasma + 4 analyses autres (liquide pleural, LCR ) 2017 (pour l instant) : 33 analyses sur plasma + 2 analyses autres Sur l année 2016 : prise en charge de 82 patients (106 analyses au total)

10 L activité de Poitiers en quelques chiffres Sur les années Dans le cadre du diagnostic 56 analyses/patient réalisées : 11% mutées Deux L858R et quatre délétions de l exon 19. Dans le cadre de la rechute 88 analyses réalisées : 31% mutées T790M. soit 61 patients : 44% mutées T790M. % d analyse à la rechute % de patients à la rechute

11 L activité de Poitiers en quelques chiffres

12 L activité de Poitiers en quelques chiffres Prise en charge des rechutes à Poitiers : Plusieurs prélèvements successifs en cas de négativité (16%) patients ont au moins eu 2 prélèvements analysés. 7 (11%) patients ont au moins eu 3 prélèvements analysés 1 (1.6%) patient a au moins eu 4 prélèvements analysés 18 patients ont eu des prélèvements successifs et 3/18 présentaient une mutation T790M au nième prélèvement

13 L activité de Poitiers en quelques chiffres

14 Bientôt Application de cette technologie: A la recherche de mutations de résistances ALK A la recherche de la mutation de résistance p.c797s (EGFR) Nombreuses autres perspectives possibles